潜在的な in vitro 抗 - 四川ドリームキャッチャー株式会社

Scientific Reports volume 12、記事番号: 21165 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

細菌やウイルスの感染は深刻な公衆衛生上の問題です。したがって、この研究は、ブラジル産レッドプロポリス (BRP) の粗水アルコール抽出物、画分、および単離された化合物の抗菌、抗バイオフィルム、および抗ウイルスの可能性と、それらの in vivo 毒性を評価することを目的としました。抗菌活性は最小阻止濃度を決定することによって評価し、抗バイオフィルム活性はバイオフィルムの最小阻止濃度（MICB50）を決定することによって評価した。生菌数（Log10 UFC/mL）も取得しました。抗ウイルスアッセイは、BHK-21 細胞をチクングニア (CHIKV) nanoluc で感染させることによって実行されました。 BRP の毒性は、線虫動物モデルで評価されました。粗水アルコール抽出物サンプルの MIC 値は 3.12 ～ 100 μg/mL の範囲でしたが、画分および単離された化合物の MIC 値は 1.56 ～ 400 μg/mL の範囲でした。BRP 粗水アルコール抽出物、オブロンギフォリン B、およびグティフェロン E は MICB50 値を示しました。単一種および複数種のバイオフィルムに対して 1.56 ～ 100 μg/mL の範囲です。ネオベストチトールとベストチトールは、CHIKV 感染をそれぞれ 93.5% と 96.7% 阻害しました。 C. elegans における毒性を評価する試験では、BRP は 750 μg/mL の濃度以下では毒性がないことが実証されました。この結果は、さまざまな感染症を治療するための代替アプローチを構成します。

保健分野における重要な進歩にもかかわらず、感染症は時間の経過とともに深刻な公衆衛生問題を構成してきました1。一例は歯周炎です。これは歯を支持する装置に影響を及ぼし、腸内毒素症のプラークバイオフィルムに存在する微生物によって引き起こされる炎症性疾患です2。 Mehrotra と Singh3 によると、アフリカ系アメリカ人の約 2.6%、アフリカ人の 5%、アジア人の 0.2%、北米人の 1%、南米人の 0.3% が最も重度の歯周炎と診断されています。歯周治療は、歯の状態を改善するだけでなく、妊娠時の副作用、心血管疾患や呼吸器疾患、がん、狼瘡、関節リウマチ、糖尿病、慢性腎臓病などの他の病理学的状態を回避するためにも不可欠です4。たとえ抗生物質で病気を治療できたとしても、治療を受けていない患者や耐性のある歯周病原菌が存在する患者では感染症が悪化する可能性があります5。

また、チクングニアウイルス (CHIKV) によって引き起こされるチクングニア熱など、重要なヒトウイルスと戦うためのワクチンや承認された抗ウイルス薬が不足しているため、ウイルス性疾患は世界の保健システムにも負担をかけています6。 CHIKV は 2014 年に確認され、ブラジルで蔓延しています7。このウイルスは、発熱、倦怠感、関節痛、多発性関節痛などのデング熱に似た症状を引き起こします8。ブラジルでは2022年4月までに28,291人のチクングニア熱疑い患者が登録され、5人の死亡が確認された。さらに8人の死亡者が調査中である9。

世界保健機関によると、世界人口のかなりの部分が依然として伝統医学に依存しており、いくつかの病気の治療に天然物を利用しています10。このような製品は主に発展途上国で使用されています。このシナリオでは、ブラジルには多様な動植物が存在するため、天然産物の貴重な供給源となります11。ブラジリアンレッドプロポリス (BRP) は、2 つの植物種 (Dalbergia ecastaphyllum 12、13 および Symphonia globulifera 14) の浸出液を収集することによって Apis mellifera ミツバチによって生産される樹脂状物質であり、新薬開発の優れた可能性を秘めています。 BRP は現在、ブラジル産プロポリスの中で最も多く生産され商品化されている種類の 1 つです。主にブラジル北東部のマングローブ林、特にアラゴアス州とバイーア州で見られます15。

BRP は、50% の樹脂、30% のワックス、10% のエッセンシャルオイル、5% の花粉、およびフラボノイド、イソフラボノイド、桂皮酸誘導体、エステル、ポリプレニル化ベンゾフェノン、一部のテルペンなどの二次代謝産物を含むその他の化合物 5% で構成されています。は、このタイプのプロポリスの主な生物学的に活性な成分と考えられています16。 BRP から単離された分子は他の種類のプロポリスには存在しないため、希少でユニークな天然産物となっています 17。この組成の変化は場所によって観察されています。いくつかの研究では、フォルモノネチンやイソリクイリチゲニンなどの化合物がアラゴアスのサンプル中に最も豊富に存在することが明らかになりました18。代わりに、「Canavieiras」サンプルでは、ベストチトール、ネオベストチトール、メディカルピン、およびポリプレニル化ベンゾフェノンが主要な化合物として特定されています17。この意味で、BRP は抗菌作用 15,18,19,20 抗寄生虫作用 21,22,23,24,25,26,27 および抗ウイルス作用 28 を有することが報告されています。

歯周炎およびCHIKV感染に対する治療選択肢の欠如を考慮して、我々はBRPおよびその単離された化合物がこれらの疾患の治療の有望な候補であるという仮説を立てました。私たちの知る限り、CHIKV に対する BRP の抗ウイルス作用に関するデータはなく、歯周病原性細菌に対する BRP の抗菌作用について報告した研究はほとんどありません 13、18、28、29、30。治療選択肢として BRP を使用すると、歯周炎症例における抗生物質の使用を減らし、CHIKV28 に対する新しい抗ウイルス戦略となる可能性があります。

この研究は、BRP 粗水アルコール抽出物、画分、単離化合物の in vitro 抗菌、抗バイオフィルム、抗ウイルス能力と、in vivo モデルにおける毒性を評価することを目的としました。

クロマトグラフィー分析により、主要化合物としてイソフラバン (ベスチトール、ネオベスチトール、7-O-メチルベスチトール)、プテロカパン (メディカルピン)、およびポリプレニル化アシルフロログルシノール (グッティフェロン E/キサントキモールとオブロンギホリン B の混合物) の存在が明らかになりました (図 1)。 BRPの。画分のクロマトグラフィープロファイルにより、ヘキサン画分にポリプレニル化アシルフロログルシノールが顕著に存在することが明らかになりましたが、ジクロロメタン、酢酸エチル、およびn-ブタノール画分は主にイソフラバンで構成されていました（補足図S1を参照）。

ブラジル産レッドプロポリス抽出物のクロマトグラフィープロファイルとその主要化合物の化学構造。番号は以下に対応します: ベスティトール (1); ネオベスチトール (2); メディカルピン (3); 7-O-メチルベストチトール (4); グッティフェロン E/キサントキモール 59; およびオブロンギフォリン B (6)。

表 1 および 2 は、研究に含まれた歯周病菌に対する粗水アルコール抽出物、画分および単離化合物の MIC 結果を示しています。粗水アルコール抽出物サンプルの MIC 値は 3.12 ～ 100 μg/mL、ジクロロメタン画分は 1.56 ～ 200 μg/mL、酢酸エチルは 12.5 ～ 400 μg/mL、ヘキサンは 3.12 ～ 400 μg/mL、 n-ブタノール 100 ～ 400 μg/mL (表 1)。

メチルベストチトールの MIC 値は 25 ～ 400 μg/mL、メディカルピン 50 ～ 400 μg/mL、ベストチトール 12.5 ～ 200 μg/mL、ネオベストチトール 12.5 ～ 100 μg/mL、オブロンギフォリン B 3.12 ～ 50 μg の範囲でした。 /mL、グッティフェロンEは1.56～200μg/mL（表2）。

BRP 粗水アルコール抽出物は、標準株 (ATCC) およびその臨床分離株の単一種バイオフィルム形成を減少させました (図 2)。さらに、Log10 CFU/mL として表される単一種バイオフィルム内の生細胞数が減少しました (図 2)。単種バイオフィルムに対してBRP粗水アルコール抽出物について得られた最低MICB50値は、A. ネスランディ（ATCC 19039）およびF. ヌクレアタム（臨床分離株）に対して3.12μg/mLでした（図2eおよびf）。他の評価された単一種バイオフィルムに対して、BRP 粗水アルコール抽出物は、MICB50 が 12.5 μg/mL であった P. intermedia (臨床分離株) を除いて、6.25 μg/mL の MICB50 を示しました。ただし、MICB50を超える濃度でも、生存可能なバイオフィルム細胞が検出されました（図2a〜f）。

ブラジル産レッドプロポリス粗水アルコール抽出物サンプルの抗バイオフィルム活性と、研究に含まれるATCC株および臨床分離株によって形成された単一種バイオフィルム内の生細胞数。 (a) P. ジンジバリス (ATCC 49417)。 (b) P. ジンジバリス (臨床分離株)。 (c) P. インターメディア (ATCC 15033)。 (d) P. intermedia (臨床分離株)。 (e) A. ネスランディ (ATCC 19039)。 (f) F. nucleatum (臨床分離株)。

試験された単離化合物に関しては、単一種のバイオフィルム形成も減少しました。オロンギフォリン B の存在下 (図 3)、最低の MICB50 は A. ネスランディ (ATCC 19039) に対して 0.78 μg/mL でした (図 3c)。他の評価された単一種バイオフィルムに対して、MICB50 値は 1.56 ～ 6.25 μg/mL の範囲でした。 6.25 μg/mL のオブロンギフォリン B は P. gingivalis (臨床分離株) 生細胞を除去し、12.5 μg/mL では P. intermedia (ATCC 15033) および F. nucleatum (臨床分離株) 生細胞を除去しました (図 3a、b)およびd）。

オロンギフォリン B の抗バイオフィルム活性と、研究に含まれる ATCC 株および臨床分離株によって形成される単一種バイオフィルム内の生存細胞の数。 (a) P. インターメディア (臨床分離株) (b) P. インターメディア (ATCC 15033)。 (c) A. ネスランディ (ATCC 19039)。 (d) F. nucleatum (臨床分離株)。

グッティフェロン E は、A. ネスランディ (ATCC 19,039) に対して低い MICB50 (0.78 μg/mL) を示しました (図 4d)。他の評価された単一種バイオフィルムに対して、MICB50 は 1.56 ～ 25 μg/mL の範囲でした (図 4a、b、c、および e)。 Guttiferone E は、P. gingivalis (臨床分離株) に対して 3.12 μg/mL、P. intermedia (ATCC 15033) に対して 6.25 μg/mL、F. nucleatum (臨床分離株) に対して 25 μg/mL の濃度からすべてのバイオフィルム細胞を除去しました。および A. ネスランディ (ATCC 19039) に対して 1.56 μg/mL。 P. gingivalis (ATCC 49417) に関しては、MICB50 を超える濃度でも生存可能なバイオフィルム細胞の存在を確認しました (図 4a)。

グッティフェロン E の抗バイオフィルム活性と、研究に含まれる ATCC 株および臨床分離株によって形成される単一種バイオフィルム内の生存細胞の数。 (a) P. ジンジバリス (ATCC 49417)。 (b) P. ジンジバリス (臨床分離株)。 (c) P. インターメディア (ATCC 15033)。 (d) A. ネスランディ (ATCC 19039)。 (e) F. nucleatum (臨床分離株)。

また、標準株（グループ 1）および臨床分離株（グループ 2）によって形成される複数種のバイオフィルムに対する BRP 粗水アルコール抽出物および単離化合物の活性も評価しました（図 5）。ＢＲＰ粗水アルコール抽出物は、グループ１の多種バイオフィルムに対して６．２５μｇ／ｍＬのＭＩＣＢ５０を有していた。しかしながら、より高濃度であっても、生細胞は依然としてバイオフィルム中に見出された。グループ 2 の多種バイオフィルムに対しても同様の結果が見られました。MICB50 は 6.25 μg/mL であり、MICB50 濃度を超える生存可能なバイオフィルム細胞も存在しました (図 5A)。

ブラジル産レッドプロポリスの粗水アルコール抽出物、オブロンギフォリン B およびグッティフェロン E のサンプルの抗バイオフィルム活性と、グループ 1 (標準株) およびグループ 2 (臨床分離株) の細菌によって形成された複数種のバイオフィルム内の生細胞数。 (A) 粗抽出物。 (B) オロンギフォリン B. (C) グッティフェロン E.

オロンギフォリン B に関しては、グループ 1 の多種バイオフィルムに対して最も低い MICB50 (1.56 μg/mL) を示しました。ただし、MICB50 を超える濃度では、細胞はバイオフィルム内で生存したままでした。グループ 2 の多種バイオフィルムに対して、オブロンギフォリン B は 50 μg/mL の MICB50 を示し、同じ濃度ですべてのバイオフィルム細胞をバイオフィルムから除去しました (図 5B)。一方、グッティフェロン E は、グループ 1 の多種バイオフィルムに対して 3.12 μg/mL の MICB50 を示し、6.25 μg/mL のグッティフェロン E はバイオフィルムからすべての細胞を除去しました。グループ 2 の多種バイオフィルムに対して、グッティフェロン E は高い MICB50 (100 μg/mL) を示しましたが、50 μg/mL のグッティフェロン E もバイオフィルムからすべての生細胞を除去しました (図 5C)。

対照 (メトロニダゾール) に関しては、単一種バイオフィルムの MICB50 は 2.95 ～ 5.9 μg/mL の範囲でした。混合バイオフィルムに関しては、MICB50 は、グループ 1 によって形成されたバイオフィルムとグループ 2 によって形成されたバイオフィルムの両方で 2.95 μg/mL でした (補足資料図 S2 および S3 を参照)。

BRP 抽出物とその単離化合物の効果をさらに評価するために、BHK 21 細胞を 50、10、および 2 μg/mL の各抽出物で処理し、16 時間後に細胞生存率を測定しました。結果は、細胞が 50 μg/mL の n-ブタノール (98.4%)、10 μg/mL の酢酸エチル (95.9%) に耐える一方、粗抽出物、ジクロロメタン、および 2 μg/mL のヘキサン (99.3、99.8、および 100%、それぞれ)、(表 3)。 CHIKV-nanoluc に感染した BHK-21 細胞を使用して、生存率アッセイで選択された最大非細胞毒性濃度で、各サンプルの抗 CHIKV 活性を評価しました。結果は、n-ブタノールが CHIKV 複製の 69% を有意に阻害することを実証しました (図 6)。他のサンプルは、CHIKV 感染に対する影響を示さなかった (図 6)。

ブラジル産レッドプロポリス粗水アルコール抽出物および画分の存在下での細胞生存率およびCHIKV複製率。

単離された物質 (メディカルピン、ネオベストチトール、ベストチトール、オブロンギフォリン B、メチルベストチトール、グッティフェロン E) については、BHK-21 細胞を 32 ～ 0.5 μg/mL の濃度の各化合物で処理しました。結果として、3 μg/mL を超える濃度の化合物で処理すると、80% を超える細胞生存率が示され (表 4)、抗ウイルスアッセイには各化合物の非細胞毒性濃度が最も高いものが選択されました。 14μg/mLのメディカルピン、ネオベストチトールおよびベストチトールは細胞毒性を示し(表4)、3μg/mLでは抗ウイルス活性を示さなかったため(補足図S4)、さらなるアッセイには代替濃度11μg/mLが選択されました。したがって、メディカルピン、ネオベストチトールおよびベストチトールの抗ウイルス活性は 11 μg/mL、グッティフェロン E およびオブロンギフィリン B は 6 μg/mL、メチルベストチトールは 14 μg/mL で試験されました。化合物メカルピン、ネオベストチトール、およびベストチトールは、インビトロでのCHIKV複製をそれぞれ86%、94%、および97%阻害した(図7)。

CHIKV感染および細胞生存率に対する単離された化合物の影響。

インビボ系におけるBRP粗ヒドロアルコール抽出物および単離された化合物の毒性を評価するために、インキュベーション時間に関連して幼虫の50%を死滅させることができる最低濃度(LC50)を決定する技術が使用された。図 8 は、BRP 粗水アルコール抽出物、オブロンギフォリン B、およびグッティフェロン E の毒性評価を時間と濃度の関数として示しています。ＢＲＰ粗水アルコール抽出物およびオブロンギフォリンＢのＬＣ５０は、インキュベーション２日目に測定して１５００μｇ／ｍＬであった（図８ＡおよびＢ）。一方、グッティフェロン E は、インキュベーションの最終日に測定された LC50 が 750 μg/mL でした (図 8C)。

C. elegans in vivo モデルにおけるブラジル産レッドプロポリスの粗水アルコール抽出物と単離化合物グッティフェロン E およびオブロンギフォリン B の毒性の評価。 (A) 粗水アルコール抽出物。 (B) オロンギフォリン B. (C) グッティフェロン E.

プロポリスは長年にわたり民間療法で感染症の治療に使用されており、その抗菌力の可能性は科学界によって実証されています15。この生物学的潜在力は、その分化した化学組成に関連している可能性があります。

セスキテルペン、プテロカルパン、イソフラバンはブラジル産レッドプロポリスの特徴です。赤色プロポリスの化学組成は、炭化水素、アルデヒド、モノテルペンを特徴とする茶色プロポリスなどの他の種類のプロポリスとは大きく異なります。そしてグリーンプロポリスは、多環芳香族炭化水素、セスキテルペン、ナフタレン誘導体を特徴としています31。

ベストチトール、ネオベストチトール、およびメディカルピンは、ブラジル、バイーア州カナヴィエイラス産の赤色プロポリスの主要化合物として報告されています。一方、ホルモノネチン、カリコシン、ビオカニン A、イソリクイリチゲニンは低濃度で検出されました 17。グティフェロン E とオブロンギフォリン B はレッドプロポリスの化学マーカーとして記載されています 14 が、調査対象サンプルではイソフラバンと比較して濃度が低いようです。トリテルペンの β-アミリンとグルチノールも、この場所から BRP に記載されています 14。

Rios と Recio 32 および Gibbons 33 によれば、植物抽出物、エッセンシャルオイル、および天然源から単離された化合物の抗菌活性を評価する場合、粗水アルコール抽出物の MIC 値が 100 μg/mL 未満、または単離された化合物の MIC 値が 10 μg/mL 未満であることが有望であると考えられています。これらの基準に基づいて、評価したすべての BRP サンプルについてここで示した MIC 値を考慮すると、BRP 粗水アルコール抽出物と単離された化合物グッティフェロン E およびオブロンギフォリン B は、評価した細菌のほとんどに対して最高の阻害活性を示しました。

赤色プロポリスのジクロロメタン画分は、各画分の個々の成分の影響に基づいて選択されたため、テストされませんでした。ヘキサン画分の主な化合物、オブロンギフォリン B およびグッティフェロン E は、ジクロロメタン画分の個々の化合物と比較して、個々の試験で良好な活性を示しました。

これらのサンプルは、主に歯周病の発症において臨床的に最も重要な種と考えられている P. gingivalis (ATCC 49417) 34 と、歯肉の炎症と歯の喪失を悪化させるため関連病原体とも考えられている F. nucleatum (臨床分離株) 細菌に対して抗菌活性を示しました 35 。これらの結果は、これらの天然産物が歯周病の制御と治療に関連していることを実証しました。この論文では、BRP 粗水アルコール抽出物、画分 (n-ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、および n-ブタノール)、および単離された化合物 (メチルベストチトール、メディカルピン、ベストチトール、ネオベストチトール、オブロンギフォリン B、およびグッティフェロン E) を分析しました。臨床分離株およびATCC株に対する抗菌活性。 ATCC 株は遺伝的観点からより安定しているため、細菌種を代表するものとなり、他の研究との比較が可能になります。 in vitro アッセイは、微生物が標的物質にどのように反応するかの信頼できる指標を提供するため、その種または属に対する結果の外挿は受け入れられるべきです。臨床分離株（野生株としても知られる）は、環境条件によって代謝が変化し、集団内の循環によって遺伝子が改変される可能性がある細菌であり、このことは、これら 2 種類の株を評価することの妥当性を正当化するものと考えられます。

他の評価対象細菌の MIC 値 (1.56 ～ 400 μg/mL) は、文献データと比較して大幅に低かった。 Bueno-Silva ら 29 は、A. ネスランディ (ATCC 12104) に対する粗抽出物と、同じ植物起源の BRP から得られた単離化合物ネオベストチトールおよびベスティトールの抗菌活性を評価し、MIC 値 25、25、および 50 を報告しました。それぞれμg/mL。ここで、ネオベストチトールとベストチトールは、評価された歯周病菌のいくつかに対して有望ではありませんでした。強調すべきもう 1 つの点は、Bueno-Silva らによって報告された A. naeslundii (ATCC 12104) に対する粗抽出物の MIC 値 29 が、A. naeslundii (ATCC 19039) に対して我々が得た値と類似しており、これは、A. naeslundii に対する種の感受性関係を示唆していることである。粗抽出物。

Santosら36は、ブラジルのミナスジェライス州「カショエイラ・ダ・プラタ」地域の異なる種類のプロポリスから得られた水性アルコール抽出物と画分（ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル）の抗菌活性を評価した。セイヨウミツバチからも採取されます。試験した細菌は、歯周病菌F. nucleatum (ATCC 10953)、P. gingivalis (ATCC 33277)、およびP. intermedia (ATCC 25611)でした。この抽出物は、F. nucleatum (ATCC 10953)、P. gingivalis (ATCC 33277)、および P. intermedia (ATCC 25611) に対してそれぞれ 1024、256、および 256 μg/mL の MIC 値を示しました。画分に関しては、MIC 値は 512 ～ > 1024 µg/mL の範囲でした。これらの細菌に対する MIC 結果は、BRP 粗水アルコール抽出物および同じ細菌種だが異なる菌株からの分画についてここで示したものよりも高かった。F に対する粗抽出物の MIC 値は 100、3.12、および 6.25 μg/mL でした。 .nucleatum (ATCC 10953)、P. gingivalis (ATCC 49417)、および P. intermedia (ATCC 15033) がそれぞれ含まれます。画分に関しては、同じ細菌に対して 12 ～ 400 µg/mL の範囲の MIC 値が見つかりました。したがって、これらの著者によって記載された結果と比較して、ここで使用されたBRP粗水アルコール抽出物および画分は、歯周病菌に対してより有効であった。

さらに、これらの著者は、粗抽出物および画分で得られた MIC 結果を ANOVA 分析によって比較しました。彼らは、評価した細菌に対する画分または抽出物の抗菌活性に差異を発見しませんでした。これは我々の結果を裏付けるものである。BRP 粗水アルコール抽出物は画分よりも有望であり、評価したすべての細菌に対してより良い値を示した一方、画分は 2 つの細菌 (P. gingivalis ATCC 49417 および臨床分離株) に対してのみ抗菌活性を示した。

Shabbir ら 37 は、スカルドゥ (パキスタン) で採取した、ミツバチ Apis mellifera から採取したニセアカシア、エレグナスアグスティフォリア (ロシア産オリーブ)、およびアカシアモデスタ由来の粗プロポリス抽出物の活性を評価しました。天然物は、P. gingivalis および P. intermedia 臨床分離株に対して 64 ～ 512 μg/mL の範囲の MIC 値を示しました。私たちの結果は、BRP 粗水アルコール抽出物から P. gingivalis および P. intermedia 臨床分離株に対して得られた MIC 値が低かったため (12.5 および 6.25 μg/mL、それぞれ）。したがって、BRP は他の種類のプロポリスには通常含まれない独特の化合物で構成されているため、他の国のプロポリスよりも有望な活性があることが証明されました 15。

これらの細菌によるバイオフィルムの形成を阻害することは、歯周炎の軽減に貢献する可能性があります。実際、Al-Ahmad et al.38 は、A. naeslundii と F. nucleatum がそれぞれ初期定着細菌と後期定着細菌の役割を果たすと記載しています。後者の細菌は、バイオフィルム形成の 62 時間後に 50% 以上の割合で存在し、炎症の増加と歯の喪失に寄与することが示されました 38。

他の研究では、他の種類の細菌に対する BRP 単一種の抗バイオフィルム活性を評価しています。 de Souza Silvaら39は、黄色ブドウ球菌（ATCC 25923）、黄色ブドウ球菌（ATCC 33591）に対するポリマーナノ粒子上にコーティングされたBRP粗水アルコール抽出物（我々の研究で使用したBRPと同じ領域で収集されたBRP）の抗バイオフィルム活性を評価した。、黄色ブドウ球菌（ATCC 43300）、および緑膿菌（ATCC 27853）。遊離BRP粗水アルコール抽出物およびナノ粒子でコーティングされた抽出物は、グラム陰性株によって形成されるバイオフィルムと比較して、グラム陽性株によって形成されるバイオフィルムをより効果的に阻害し、バイオフィルム阻害濃度値は15.6～125μg/mLの範囲であった。黄色ブドウ球菌株に対しては 100 ～ 1560 μg/mL、緑膿菌株に対しては 100 ～ 1560 μg/mL。グラム陽性菌 A. ネスランディ (ATCC 19039) に対する MICB50 の最低値が粗抽出物で 3.12 μg/mL、単離化合物オブロンギフォリン B およびグッティフェロン E で 0.78 μg/mL であることが確認されたことを考慮すると、これらの結果は我々の発見を裏付けました。

Miranda et al.13 は、ここで使用した BRP と同じ植物起源の BRP の粗水アルコール抽出物の抗バイオフィルム活性を評価しました。これらの著者は、評価した細菌を複合体 (放線菌、紫、黄、緑、オレンジ、赤など) に分割しました。著者らは、800 μg/mL および 1,600 μg/mL の抽出物濃度で、これらの複合体によって形成される複数種のバイオフィルムの代謝活性がそれぞれ 40 および 45% 減少することを示しました。 de Figueiredo ら 30 はまた、BRP 粗抽出物の抗バイオフィルム活性を 1600、800、および 400 μg/mL で評価し、バイオフィルム代謝活性がそれぞれ 56、56、および 57% 減少したことがわかりました。私たちの研究では根絶を評価しませんでしたが、BRP サンプルのバイオフィルム形成を阻害する能力を評価しました。 Wei et al.40 によれば、バイオフィルム形成の阻害は細菌の増殖を防ぎ、ひいては細菌の成熟を防ぐため、バイオフィルム形成を根絶することよりもバイオフィルム形成を阻害することの方がはるかに重要です。ここに示した結果は、BRP サンプルが歯周病菌による複数種のバイオフィルム形成を少なくとも 50% 阻害することを実証しました。オロンギフォリン B は、ATCC 株によって形成された複数種のバイオフィルムに対して最も低い MICB50 値 (1.56 μg/mL) を示しました。臨床分離株によって形成された複数種のバイオフィルムに関しては、MICB50 の最低値は 6.25 μg/mL でした。これらの結果は、単離された化合物であるオブロンギフォリン B とグッティフェロン E が、この研究に含まれる細菌によって形成されるほとんどの単一種および複数種のバイオフィルムの生細胞すべてを阻害することを示唆しました。これは、BRP サンプルがバイオフィルムの形成を阻害し、この細菌群集内の細胞に到達して細胞を除去し、生細胞を含まない糖タンパク質複合体のみを残す可能性があることを指摘しました 13。

この論文で見つかったMICB50値は、特に一般に耐性が高く、より高い濃度を必要とする臨床分離株の場合、比較的低いことに言及する価値があります。しかし、バイオフィルム形成を少なくとも 50% 阻害できる最低濃度、いわゆる MICB50 では、バイオフィルムの少なくとも 50% の阻害を実証しました。言い換えれば、これはバイオフィルムの完全な阻害には相当せず、おそらくより高い濃度が必要となるでしょう。

フラボノイド、エステル、アルコール、エッセンシャルオイル、その他の有機化合物などのプロポリスの生理活性成分は、ヘルペスウイルス (HSV-1 および HSV-2)、シンドビスウイルス、パラインフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、 HIV、水痘帯状疱疹（HSV-1 および HSV-2）、シンドビスウイルス、パラインフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、HIV、および水痘帯状疱疹41、42。この研究で実証された BRP 抗菌活性および抗バイオフィルム活性に加えて、我々は BRP 粗水アルコール抽出物、画分、および純粋物質の抗 CHIKV 活性を評価しました。 BRP サンプルの存在下での BHK-21 細胞の生存率を MTT アッセイによって評価しました。創薬では、細胞生存率が 50% を超える場合、サンプルは無毒であると見なされ、細胞生存率が 25 ～ 50% の間で変化する場合は中程度の細胞毒性があると見なされ、細胞生存率が 25% 未満である場合は高度に細胞毒性があると見なされます 43。この研究では、評価されたすべてのサンプルは、粗抽出物および画分については 50 μg/mL、単離された化合物については 3 μg/mL の濃度で 80% 以上の細胞生存率を示しました (表 3 および 4)。この研究で評価されたすべての BRP サンプルは、80% 以上の BHK-21 細胞生存率を示しました (表 3 および 4)。これは、Rufatto らによって発見された細胞生存率よりも高かったです。 20、(14.5 ～ 46%)。

感染アッセイに関しては、単離された化合物であるネオベストチトールとベストチトールが、それぞれ 94 ％と 97％のウイルス感染阻害率という最も有望な結果をもたらしました（図 7）。抗CHIKV活性を含む抗ウイルス活性を有するいくつかの天然化合物が記載されているにもかかわらず、ネオベスチトールおよびベスティトールの抗ウイルス能力はスクリーニングされていない。私たちの結果は、天然分子を用いた他の研究で報告されたものよりも高い阻害率を示しました。Pohjalaらの研究44では、356の化合物をスクリーニングした際に最大75%の感染阻害限界が得られ、そのうち123は天然化合物でした。。私たちの知る限り、BRP または単離された化合物の抗 CHIKV 活性に関する報告はありません。これは、抗ウイルス治療の候補として BRP の可能性を活用することの重要性を示しています。私たちの研究は、BRP 抗 CHIKV 活性の評価の先駆けとなり、発現阻害率を達成し、CHIKV および他のウイルスに対する抗ウイルス薬の開発への道を切り開きました。

BRP を安全に適用するには、その毒性をさまざまな実験モデルで評価する必要があります。マウスモデルは、治療の毒性を評価するために最もよく使用される in vivo モデルですが、コストが高い、メンテナンスが難しい、結果が得られるまでに時間がかかるなどの欠点があります 45。したがって、ここでは、消化器系、生殖系、内分泌系、神経筋系を備えた完全な動物である線虫 C. elegans という別の in vivo モデルを使用して毒性を評価しました。 C. elegans は、小型でライフサイクルが短く、維持が容易であることに加えて、ヒトと 60 ～ 80% の遺伝的相同性を持っています 46。これに関連して、我々は、線虫に対する毒性について最も有望な BRP サンプルを評価しました。幼虫の少なくとも 50% を殺すことができる最低濃度 (LC50) は、BRP 粗水アルコール抽出物とオブロンギフォリン B については 1500 μg/mL、グティフェロン E については 750 μg/mL でした。これらの値は、すべての MIC および MICB50 よりも有意に高かったです。この研究で報告された濃度。

さらに、この濃度未満では、幼虫を BRP サンプルに 2 日間曝露した後でも LC50 に達せず、これらの天然産物の無毒性プロファイルが実証されました。興味深いことに、この研究で得られた C. エレガンスに対する BRP サンプルの LC50 値は、C. エレガンスに対して評価された他の種類のブラジル産プロポリスの LC50 値よりも高かった。たとえば、Campos と共同研究者 (2015)47 は、プロポリスサンプルの LC50 が 461.8 μg/mL であると報告しました。ここで、有毒であると判断された BRP 濃度は高く、最高の MIC 値 (400 μg/mL) を上回っていました。したがって、プロポリスはこの研究で使用された濃度では毒性がなく、1500 および 750 μg /mL 未満の濃度では安全に使用できます。さまざまな方法論を通じて、歯周病原性細菌のパネルに対してブラジル産レッドプロポリスの抗菌活性が実証されたため、ここで得られた結果は非常に関連性があります。強調すべきもう 1 つの点は、BRP 単離化合物の抗 CHIKV 活性です。チクングニヤ感染症は発生率も重症度も高いため、新しい治療選択肢の探索が強く望まれています。私たちの結果は、さまざまな感染症を治療するための代替アプローチとしての BRP のさらなる研究への最初のステップを構成します。

この研究で使用されたブラジル産レッドプロポリスは、歯周病原性細菌のパネルに対して抗菌活性を持っています。さらに、その粗抽出物および単離された化合物であるオブロンギフォリン B およびグッティフェロン E は、MIC 濃度と同等またはわずかに高い濃度で、単一種および複数種のバイオフィルムを 50% 以上阻害します。メディカルピン、ネオベストチトール、およびベストチトールは、in vitro で CHIKV 感染を強力に阻害します。さらに、C.エレガンスに対する毒性試験により、粗抽出物であるオブロンギフォリンBおよびグッティフェロンEは無毒であることが証明され、将来、これらのプロポリスサンプルが医薬品として使用できるよう安全かつ有望であることが証明されました。

BRPは、2019年3月にブラジルのカナヴィエイラス・バイーア州のカナヴィエイラス養蜂家協会（COAPER）で収集されました。 Santiago et al.48 の記載に従って、BRP を凍結し、70% 水アルコールエタノール溶液で抽出しました。 BRP粗水アルコール抽出物を有機溶媒(ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、およびn-ブタノール)で分配した。私たちの研究グループによって以前に分離された BRP の本物の標準物質 (7-O-メチルベストチトール、メディカルピン、ベストチトール、ネオベストチトール、オブロンギフォリン B、およびグッティフェロン E) をサンプルの特性評価に使用しました 17。

BRP 抽出物とその画分のクロマトグラフィー分析は、2998 フォトダイオードアレイ検出器 (PDA) に接続された Waters 2695 HPLC 機器で、コントローラーとして Empower 3 ソフトウェアを使用して実行されました。クロマトグラフィープロファイルは、Supelco Ascentis Express C-18 (150 × 4.6 mm、2.7 μm) カラムで実行されました。水 (A) (0.1% ギ酸) およびアセトニトリル (B) を含む移動相を次のように使用しました: 80 分まで B の 10 → 100%。 89 分で B が 100%。 90分で100→10％、95分までその状態を維持。注入は、流速 1 mL/min、温度 40 °C、注入量 10 μL で実行されました。クロマトグラムは 275 nm で記録されました。

抗菌、抗ウイルス、および毒性のアッセイには、BRP の粗水アルコール抽出物、ジクロロメタン、ヘキサン、酢酸エチル、n-ブタノールの画分、および単離された化合物であるグッティフェロン E、オブロンギフォリン B、メチルベストチトール、メディカルピン、ベスティトール、およびネオベスチトール。

抗菌および抗バイオフィルム活性アッセイに使用した歯周病原性細菌株は、American Type Culture Collection (ATCC) から入手しました。それぞれの臨床分離株はヒトの歯周感染症から得られました。菌株には、ポルフィロモナスジンジバリス（ATCC 49417 および臨床分離株）、フソバクテリウムヌクレアタム（ATCC 10953 および臨床分離株）、プレボテラインターメディア（ATCC 15033 および臨床分離株）、および放線菌ネスランディ（ATCC 19039 および臨床分離株）が含まれていました。これらの細菌は、ウベルランジア連邦大学 (UFU) の抗菌アッセイ研究所 (LEA、ポルトガル語の略称) のコレクションの一部であり、-20 °C で凍結保存されていました。インビボ毒性アッセイでは、遺伝学センター (CGC、ミネソタ大学) から入手した変異株 Caenorhabditis elegans AU37 を使用しました。

抗ウイルスアッセイのために、CHIKV LR2006PYY1 株 (東/中央/南アフリカ遺伝子型) に基づくナノルシフェラーゼレポーター (CHIKV-nanoluc) を発現する CHIKV が救出されました 49。プロトコールは前述のように実行されました50。

BRP 粗水アルコール抽出物、画分、および単離された化合物の抗菌活性を、ブロス微量希釈法によって 3 回評価しました。アッセイは 96 ウェルマイクロプレートで実施されました。 Clinical and Laboratory Standards Institute52 が推奨する方法論に修正を加えて従った。接種材料は McFarland 0.5 スケールに標準化され、ウェル内で細菌濃度 1.5 × 106 CFU/mL に希釈されました。サンプルを調製するために、BRP 粗水アルコール抽出物、画分、または単離された化合物を 5% ジメチルスルホキシド (DMSO) に可溶化し、ヘミン (5.0 mg/mL) およびメナジオン (1.0 mg/mL) を添加したブルセラブロスで希釈しました。 0.195 ～ 400 μg/mL の濃度範囲の 2 倍段階希釈を使用しました。 5% DMSO の制御が行われ、この濃度では溶媒は細菌の増殖を妨げませんでした。また、以下の対照も実施しました。接種材料（試験で使用したすべての細菌 + 培地）、細菌の生存率を観察しました。培地が無菌であることを保証するためのブロス。この溶液が無菌であることを保証するために、BRP サンプルを使用します。マイクロプレートを嫌気チャンバー（Don WhitleyScientific、ブラッドフォード、英国）内で嫌気条件（80% N2、10% CO2、および 10% H2）下、37 °C で 72 時間インキュベートしました。レザスリンは細菌の増殖を明らかにするために使用されました。青色は細菌の増殖がないことを示し、ピンク色は細菌の存在を示しました53。対照技術として、対照細菌バクテロイデスフラジリス (ATCC 25285) およびバクテロイデスシータイオタオミクロン (ATCC 29741) に対して、0.0115 ～ 5.9 μg/mL のメトロニダゾールが使用されました 52。

抗バイオフィルム活性を評価するために、4 つ以上の細菌に対して最も有望な MIC 結果を示した BRP サンプルをバイオフィルム最小阻止濃度 (MICB50) アッセイに供しました。 MICB50 は、バイオフィルム形成を少なくとも 50% 阻害できる微生物剤の最低濃度として定義され 40、次の方程式を使用して計算されます。

ここで、MICB50 は、CLSI ガイドライン (2007)52 に記載されているとおりに修正を加えて決定されました。まず、分析された株の固着モードで増殖する能力が検証されました。 1.5 × 106 CFU/mL のすべての株は、37 °C で 72 時間インキュベートした後、単一種および複数種のバイオフィルムを形成しました (データは示されていません)。

単種バイオフィルムの場合、1.5 × 106 CFU/mL の各細菌接種材料 100 μL を、0.195 ～ 400 μg/mL の濃度で評価するプロポリスサンプル (粗水アルコール抽出物、オブロンギフォリン B およびグッティフェロン E) を含むウェルに添加しました。。マイクロプレートを嫌気チャンバー内で 37 °C で 72 時間インキュベートしました。複数種のバイオフィルムについては、口腔バイオフィルムで見つかった主な歯周病原性細菌が選択され、2 つのグループに分けられました。グループ 1 は標準細菌 (P. gingivalis ATCC 49417、P. intermedia ATCC 15033、および A. naeslundii ATCC 19039) のみで構成されていました。一方、グループ 2 は P. gingivalis、P. intermedia、および F. nucleatum の臨床分離株のみで構成されていました。最も有望な BRP サンプルの抗バイオフィルム活性を、グループ 1 の細菌によって形成された複数種のバイオフィルムおよびグループ 2 の細菌によって構成された複数種のバイオフィルムに対して評価しました。この目的のために、評価対象の各細菌 33.33 μL、合計 100 μL の細菌接種材料を 1.5 × 106 CFU/mL で、0.195 ～ 400 μg/mL の濃度で評価するプロポリスサンプルを含むウェルに添加しました (粗水アルコール抽出物) 、オブロンギフォリン B およびグッティフェロン E）。マイクロプレートは、単種バイオフィルムマイクロプレートと同じ条件下でインキュベートされました。標準抗生物質メトロニダゾールを、MIC50 で 0.0115 ～ 5.9 μg/mL の濃度で対照として使用しました (補足資料、図 S2 および S3 を参照)。 5% DMSO の制御が行われ、この濃度では溶媒は細菌の増殖を妨げませんでした。また、以下の対照も実施しました。接種材料（試験で使用したすべての細菌 + 培地）、細菌の生存率を観察しました。培地が無菌であることを保証するためのブロス。この溶液が無菌であることを保証するために、BRP サンプルを使用します。インキュベーション後、上清培養物を取り出し、超純蒸留水でウェルを洗浄することによって浮遊細胞を除去した。単一種および複数種のバイオフィルムをメタノールで固定し、2% クリスタルバイオレットで染色しました 54。読み取りはマイクロプレートリーダー(GloMax(登録商標))で595nmで実施した。読み取りはマイクロプレートリーダー(GloMax(登録商標))で595nmで行った。実験は 3 回の独立したイベントで実行されました。

このアッセイは、以下に説明するように、de Souza Silva et al.39 に従って単一種および複数種のバイオフィルムに対して実行されました。 2 つのマイクロプレートをインキュベートし、1 つは MICB50 測定用、もう 1 つは微生物数測定用に使用しました。微生物計数用マイクロプレートをインキュベートした後、上清を取り除き、ウェルを超純蒸留水で洗浄することにより浮遊細胞を除去した。続いて、追加されたブルセラブロスをすべてのマイクロプレートウェルに添加し、超音波浴後にバイオフィルムをウェルから剥離した。次に、96 ウェルマイクロプレートの各ウェルで 10 倍の段階希釈を実行し、有効な各希釈に対応する各ウェル 50 μL を、馬の血液 (5%)、ヘミン (5.0 mg) を補充したブルセラ寒天の 2 つのプレート上に置きました。 /mL)、およびメナジオン (1.0 mg/mL)。 Harrison et al.55 の記載に従って、各プレートを 8 つの部分に分別し、嫌気チャンバー内で 37 °C でインキュベートしました。 72 時間後、各プレートでコロニー形成単位 (CFU) のカウントを実行しました。結果は Log10 (CFU/mL) として表され、アッセイは独立して 3 回実行されました。

BHK-21 細胞 (シリアンゴールデンハムスター腎臓由来の線維芽細胞; ATCC CCL-10) を、100 U/mL ペニシリン (Hyclone Laboratories)、100 mg/mL ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、Sigma-Aldrich) 中で維持しました。 37 °C の加湿 5% CO2 インキュベーター内で、非必須アミノ酸のストック (Hyclone Laboratories) の 1% 希釈液 (Hyclone Laboratories)、および 1% ウシ胎児血清 (FBS、Hyclonen Laboratories)。

試験した BRP サンプルの存在下での BHK-21 細胞の生存率は、MTT [3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド] (Sigma-Aldrich) アッセイによって測定されました。 BHK-21 細胞を 48 ウェルマイクロプレートで培養し、さまざまな濃度の試験した BRP サンプルで 37 °C で 16 時間処理しました。次に、試験した BRP サンプルを含む培地を 48 ウェルマイクロプレートから除去しました。次に、1 mg/mL MTT 溶液を各ウェルに添加し、30 分間インキュベートし、300 μL の DMSO に置き換えてホルマザン結晶を可溶化しました。吸光度は、Glomaxマイクロプレートリーダー(Promega)で490nmで測定した。細胞生存率は、式 (T/C) × 100% に従って計算されました。ここで、T と C は、それぞれ処理されたウェルと対照グループの光学密度を表します。 DMSO を未処理の対照として使用しました50。

BRP 粗水アルコール抽出物および単離された化合物の抗 CHIKV 活性の初期スクリーニングのために、感染の 24 時間前に HK-21 細胞を 48 ウェルマイクロプレートにウェルあたり 5 × 104 細胞の密度で播種しました。感染多重度 56 が 0.1 の CHIKV-nanoluc と、試験した単離化合物または抽出物を同時に細胞に添加しました。感染後 16 時間 (hpi) で細胞をウミシイタケルシフェラーゼ溶解緩衝液 (Promega) に採取し、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイシステム (Promega) でナノルシフェラーゼ活性を測定することでウイルス複製を定量しました。 CHIKV 複製率は、式 (T/C) × 100% に従って計算されました。ここで、T と C は、それぞれ処理されたウェルと対照グループの光学密度を表します。 DMSO 0.1%を未処理の対照として使用しました。

Andrade et al.57 および Singulani et al.58 に従って、C. elegans の in vivo モデルを使用して、CIM 内の最も有望な BRP サンプルについて毒性評価が実行されました。 C. エレガンス AU37 変異株を、大腸菌 OP50 を播種した線虫増殖培地 (NGM) プレートで培養し、16 °C で 72 時間インキュベートしました。インキュベーション後、幼虫と卵を含む NGM プレートを M9 バッファーで洗浄し、上清を 15 mL コニカルチューブに入れました。さらに漂白液（次亜塩素酸塩＋NaOH）を加えて成虫を死滅させた。卵を NGM プレートに置き、15 °C で 24 時間再度インキュベートしました。その後、L1/L2 段階の幼虫を含む NGM プレートを M9 緩衝液で洗浄し、上清を大腸菌 OP50 を播種した NGM プレートに移し、16 °C で 24 時間インキュベートしました。同期後、10 ～ 20 匹の L4 期幼虫を含む NGM プレート内容物 20 μL を 96 ウェル平底マイクロプレートの各ウェルに添加し、16 °C で 72 時間インキュベートしました。 BRP 粗水アルコール抽出物は 750 ～ 6000 μg/mL で評価され、単離された化合物であるオブロンギフォリン B およびグッティフェロン E は 5.85 ～ 1500 μg/mL で評価されました。 DMSO を溶媒として使用しました (最終濃度 ≤ 1%)。

倒立顕微鏡下で連続 3 日間、24 時間ごとに幼虫を数えました。動いている幼虫は生きていると見なされ、触れた後でも静止しているものは死んでいると考えられました。各サンプルについて、致死濃度 (LC50) と呼ばれる、幼虫の 50% を殺すことができる最低濃度が時間に従って決定されました。

個々の実験は 3 回実行し、結果の再現性を確認するためにすべてのアッセイを少なくとも 3 回実行しました。読み取り値の平均間の差異は、ソフトウェアGraph Pad Prism 8.0 (Graph Pad Software)を使用して実施される分散分析(一元配置または二元配置ANOVA)またはスチューデントのt検定によって比較されました。 p 値 ≤ 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。

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この研究は、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP Grant # 2017/04138–8)、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG # 12138—奨学金付与; APQ-03385–18) によって資金提供されました。 APQ-01487–22）、高等教育職員の改善のための調整（CAPES 財政コード 001—奨学金の付与および発生、風土病、伝染病およびパンデミックの予防と闘い—財務コード #88881.506794/2020–01）および国家開発評議会科学および技術 (CNPq 助成金 # 307974/2019–7)。

生物医科学研究所 (ICBIM)、ウベルランジア連邦大学、ウベルランジア、ブラジル

ナジェラ・ベルナデリ・ソウザ・シウバ、ジョナサン・エンリケ・デ・ソウザ、マリアナ・ブレンティーニ・サンティアゴ、ジェニファー・ロドリゲス・ダ・シルバ・アギア、ダニエル・オリベイラ・シウバ・マルティンス、イゴール・デ・アンドラーデ・サントス、アナ・カロリーナ・ゴメス・ジャルディム、カルロス・エンリケ・ゴメス・マルティンス

生物科学・文学・精密科学研究所 (IBILCE)、サンパウロ州立大学、サン・ジョゼ・ド・リオ・プレト、ブラジル

ダニエル・オリベイラ・シルバ・マルティンス & アナ・カロリーナ・ゴメス・ジャルディム

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ラファエル・アウベス・ダシルバ

サンパウロ大学 (USP) リベイランプレト薬学部、リベイランプレト、ブラジル

ジェニファー・A・アルダナ・メヒア & ハイロ・ケヌップ・バストス

ブラジル、ウベルランジア連邦大学保健専門学校 (ESTES)

レジナルド・ドス・サントス・ペドロソ

Exact and Technological Sciences Nucleus、フランカ大学 (UNIFRAN)、フランカ、ブラジル

セルヒオ・リカルド・アンブロージオ & ロドリゴ・カッシオ・ソラ・ヴェネツィアーニ

ヘルスプロモーション大学院プログラム、フランカ大学 (UNIFRAN)、フランカ、ブラジル

レジーナ・ヘレナ・ピレス

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シルバ、NBS、デ・スーザ、JH、サンティアゴ、MB 他ブラジル産レッドプロポリスの in vitro 抗歯周病原性、抗チクングニア熱活性および in vivo 毒性の可能性。 Sci Rep 12、21165 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-24776-4

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受信日: 2022 年 8 月 22 日

受理日: 2022 年 11 月 21 日

公開日: 2022 年 12 月 7 日

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