ミツバチの性的二型性の眼の分化を制御する遺伝子スイッチの機能と進化

Nature Communications volume 14、記事番号: 463 (2023) この記事を引用

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動物は、生物間で異なる性特異的な形態構造を発達させます。しかし、これらの形質を支配する発生および進化のメカニズムの理解は依然として限られており、主にDMドメイン遺伝子に限定されています。DMドメイン遺伝子は、遺伝子モデルで同定された保存された性特異的な発生制御因子です。今回我々は、ミツバチの性的二型性の眼の分化を選択的に調節する性特異的な発生調節遺伝子、グルブシャウゲ（glu）を報告する。われわれは、性決定遺伝子フェミニザー（fem）がglu転写産物の性特異的スプライシングを制御し、ジンクフィンガー（ZnF）ドメインを持つGluタンパク質がメスでのみ発現する遺伝子スイッチを確立していることを発見した。私たちは、女性のコード配列が部分的な女性化には必須かつ十分であることを示しました。配列と機能の比較研究により、遺伝子スイッチの進化的起源の後に、必須の ZnF ドメインの突然変異起源が続いたことが明らかになりました。我々の結果は、gluが二形性の領域特異的調節のための新しく進化した性特異的遺伝子スイッチであることを実証している。

動物では、オスとメスの形態学的違いは非常に一般的です。このような性的二型の発達は、直接的または間接的に、保有者の適応度を高めます。一部の甲虫の誇張された角やクジャクの尾の色模様と大きさは、そのような性的二形構造の興味深い例を提供します。さまざまな動物系統における新しい性的特徴の進化的出現により、生物間の顕著な違いが確立されます。しかし、性的二型を支配する分子の発生および進化のメカニズムに関する私たちの知識はまだ限られています。これは、研究が限られた数の性的二形形質に焦点を当てており、発生制御因子の体系的な探索が非常に少数の遺伝子モデルで行われていることが部分的に原因です。

性決定は、通常、遺伝子のカスケードを介して、性分化の仲介側面を担う性特異的に制御される発達調節因子に伝達される二値シグナルを確立します1、2、3。脊椎動物では、性決定経路によって生殖腺の性別が決まります。生殖腺は、非生殖腺組織の性的運命を調節する性ホルモンを生成します。無脊椎動物では、一次性決定シグナルは転写因子である発生調節因子に伝達されます。その結果、性的運命については純粋に細胞が自律的だが調整された決定が行われる。無脊椎動物の性的二型の重要な発生調節因子の 1 つは、DM ドメイン遺伝子 1,2,4 です。この遺伝子は、ジンクフィンガーモチーフ型 DNA 結合ドメインが絡み合った DM ドメイン型の転写因子をコードしており、生殖器官の仕様に関与しています 1,5。他の体の部分におけるDMドメイン遺伝子によって制御される性的二型は、線虫Caenorhabditis elegansの雄の尾部の形態形成6,7、甲殻類オオミジンコの雄特有のアンテナと交尾胸部フック8、キイロショウジョウバエの雄の前脚の性櫛9,10であり、性的二型である。一部の甲虫の角の構造が誇張されている 11、12、13 およびその他の特徴 4、14、15、16、17、18。これらの研究から明らかになる一般的な特徴は、DM ドメイン遺伝子は、一方の性に限定された活性 (オンまたはオフの活性状態)、または性別間で異なる活性を提供するため、性特異的な遺伝子スイッチとして機能する発生制御因子であるということです。体系的なスクリーニングにより、doublesex (dsx) 遺伝子 (昆虫の DM ドメイン遺伝子の 1 つ) がキイロキイロショウジョウバエの性分化の主要な発生制御因子であることが明らかになりました。これは、この遺伝子がこの種のほぼすべての性的二型特性を指定しているためです 19,20。しかし、他の性的二形特性がどのように制御されているかはほとんどわかっていません。

私たちの以前の研究は、生殖器以外にミツバチ Apis mellifera の外部性的二型特性が dsx 遺伝子によって指定されていないことを示唆しました 21。これらの特徴には、メスよりもオスの方が約4倍大きい複眼が含まれます（補足図1Aの野生型（wt）表現型を参照）。これはおそらく、交尾飛行中にオスと女王を見つけるための適応であると考えられます22、23、24。 dsx機能喪失変異体における眼の大きさの定量的測定により、dsx遺伝子は性的二形性の眼の発達に必要ではないことが示された（補足図1B）。

この知識に基づいて、私たちは別の性特異的な発達調節因子を体系的に探索することになりました。私たちは、性的二型形質形成の根底にある発生および進化のメカニズムを深く理解することを目的として、性的二型の機能をテストし、この他の調節因子の進化的起源を調べたいと考えました。私たちは、性的二型性の眼の分化を選択的に指定する遺伝子を同定し、これを glebschauge (glu) と名付けました。この遺伝子は、女性と男性に異なる活性をもたらすため、性別特異的な遺伝子スイッチとして機能します。女性特異的な転写物のみがジンクフィンガー（ZnF）を持つタンパク質をコードします。我々はさらに、女性特有のコード配列が構造全体の部分的な女性化に必須かつ十分であることを示した。進化の順序と機能の比較研究により、この遺伝子が性決定経路に新たに動員され、その後、必須のZnFモチーフが進化的に獲得されたことが明らかになった。私たちの結果は、glu が単一構造である複眼の性的二形性を制御する、新しく進化した性特異的発達調節因子であることを示しています。まとめると、これらの発見は、さまざまな身体部分の性的二形特性が、さまざまな性特異的な発達制御因子である glu と dsx によって指示される、領域特異的な制御を示唆しています。

dsx 遺伝子以外の性的二型発生の制御因子を同定するために、性特異的にスプライスされた転写産物をスクリーニングしました。ミツバチでは、相補性決定因子（csd）遺伝子のヘテロ接合またはホモ接合/ヘミ接合遺伝子型が性決定の主要なシグナルです（図1a）。 csd 遺伝子は、フェミニザー (fem) 転写産物の女性および男性に特異的なスプライシングを制御し、女性でのみ機能的な Fem タンパク質を生成します 25,26。したがって、fem 遺伝子は女性または男性の発育全体を制御します 25,26。メスで発現されたFemタンパク質は、生殖腺の発達を指定する発生調節遺伝子dsxの転写産物の少なくともメス特異的なスプライシングを指示する（図1a）21。 fem 転写産物の雄スプライスバリアントはデフォルトで生成されます 25,26。私たちは女性と男性の胚トランスクリプトームシーケンス27を実行し、女性にのみ存在し男性には存在しない性特異的なスプライスジャンクションを検索しました（図1b）。これらの転写物は、ショウジョウバエのトランスフォーマータンパク質のオルソログである Fem タンパク質によって制御されている可能性があります 25,26。われわれは、グルブシャウゲ遺伝子（glu、遺伝子ID 552468）の転写物が性特異的にスプライシングされており、ジンクフィンガーモチーフを持つタンパク質が女性でのみ発現できることを発見した。

a 生殖器官分化の性特異的発生調節因子としてのdsx遺伝子を用いた性決定経路のモデル。タンパク質と転写産物の性特異的スプライシングが模式的に示されています。 A と B は、異なる csd 対立遺伝子に由来するタンパク質変異体です。異なる色は、性特異的にスプライシングまたは発現されるエクソンおよびタンパク質を示します。 csd：相補性決定遺伝子。 fem：フェミニザー遺伝子。 b 性特異的にスプライシングされ、fem 遺伝子によって調節される他の発生調節因子を同定するために採用された実験戦略。胚におけるトランスクリプトーム分析により、性特異的にスプライシングされた転写物が同定されました。コード配列分析により、DNA 結合ドメインの可能性があることが特定されました。

男性と女性の胚および成体からのRNA-seqリードとRT-PCRアンプリコン配列をゲノム配列にマッピングしたところ、glu遺伝子が10個のエクソンで構成されていることがわかりました（図2a）。転写物は2つの転写開始部位（図2a、b）から転写され、選択的にスプライシングされます。これは、エクソン2、3、および4の少なくとも3つの可能な翻訳開始部位が使用されることを示唆しています。エクソン 8 のスプライスアクセプター部位は性特異的であり、これによりエクソン 8 のオープンリーディングフレームがシフトします (ORF、図 2c)。したがって、転写物は、N末端および性特異的なC末端アミノ酸配列を共有する女性および男性特異的なタンパク質変異体を発現することができる。共有領域は 210 ～ 316 アミノ酸の長さです。このタンパク質の女性特異的部分は 1256 個のアミノ酸で構成され、DNA 結合ドメインの可能性がある CCHH タイプの ZnF モチーフを保持しています 28。男性特異的領域の長さはわずか 16 アミノ酸です。我々は、glu遺伝子は、男性には存在しないZnFドメインを持つタンパク質を女性に特異的に発現させることができると結論づけた。 Glu タンパク質では、ZnF ドメイン以外の保存されたモチーフは予測されませんでした。

glu 遺伝子のゲノム構成のスキーム。赤い矢印とゲノム構造の上の数字は、CRISPR/Cas9 変異誘発に使用される sgRNA の標的部位を示します。 b 女性および男性に特異的な転写物およびタンパク質。ボックスはエクソンを示します。 ORF の女性特有の部分は赤で表示され、男性特有の部分は青で表示され、共通部分は濃い灰色で表示されます。 CCHH ジンクフィンガーモチーフ (ZnF) の位置は黄色で示されています。 c 性特異的にスプライスされたエクソン 7 と 8 の境界。 mRNAのコードヌクレオチド配列とコードされたアミノ酸が示されています。

glu 遺伝子が fem 遺伝子によって制御されているかどうかを調べるために、fem 遺伝子に終止コドンを導入し、glu 転写物の有性スプライシングを研究しました。初期終止コドンは、CRISPR / Cas9 法 29 と効率的な体細胞突然変異アプローチ 21 を使用して、エクソン 3 と両方の対立遺伝子のフレームシフト突然変異を介して導入されました（補足図 2）。これらの fem -/- 変異は、男性の調節状態を模倣します (図 1a)26。モザイク現象のない変異個体をスクリーニングしました21。これは、各個体のアンプリコンのディープシークエンシングによって特定されました（補足表1）。我々は、遺伝的雌における雄のdsx転写物のみを検出することにより、fem -/- 変異が機能喪失変異であることを確認した（図3aおよび補足表2）。これらのfem -/- 雌では雄のgluスプライス変異体のみが検出されたが、野生型雌では雌のglu転写物のみが検出された（図3a）。このスプライシングの変化は、glu 転写物の雌性スプライシングが fem 遺伝子によって直接的または間接的に制御されていることを示しています。

a fem -/- 変異に応答した glu 転写物の性特異的スプライシング。個々のステージ 1 の雌幼虫を分析しました。上のパネル: RT-PCR からのサイズ分解アンプリコン。参照として ef-1α (ef1α、伸長因子 1α) 転写物を使用して個体間で半定量的に調整されました。女性特異的 (gluF) および男性特異的 (gluM) glu フラグメントを単一のプライマーペアで増幅しました。表: gluF を検査した個体数。 gluM 転写物の存在量は低く、変異体では増幅が一貫していませんでした。 gluDNA：DNA。 b dsx stop/stop雌変異体におけるgluスプライシングおよびglu Δex2-8/Δex2-8雌変異体におけるdsxスプライシング。 4 ～ 5 匹の蛹または成体の触角をプールし、分析しました。 wt: 野生型コントロール。 C: PCR のネガティブコントロール。

glu と dsx が fem 遺伝子の制御下で並行して動作する遺伝子であるかどうかをさらに理解するために、dsx 機能喪失変異体における glu スプライシングと glu 機能喪失変異体における dsx スプライシングを研究しました。ここでも、CRSPR/Cas9 法を使用して、雌の dsx 遺伝子 (dsx stop/stop)21 および glu 遺伝子 (glu Δex2-8/Δex2-8; sgRNA 1 および 3) に対して両対立遺伝子変異を生成しました。 dsx活性の欠如がgluスプライシングに影響を与えていないことを観察しました（図3b）。さらに、glu活性の欠如はdsxスプライシングに影響を与えません（図3b）。これらの結果は、glu 転写物のスプライシングが dsx 活性に依存しないこと、および dsx 転写物のスプライシングが glu 活性を必要としないことを示しました。我々は、dsx と glu は 2 つの性特異的に制御される遺伝子であり、fem 遺伝子の制御下で性決定経路の平行枝で機能すると結論付けています。

男性の転写産物が、fem遺伝子からの入力に依存しないデフォルトの制御状態であるかどうかを判断するために、性決定経路の開始前後のさまざまな胚段階でのグルスプライシングを研究しました26,30。生後0〜15時間の胚では、後期段階で男性に特異的な変異を1つだけ検出しました（図4a）。 25 時間以降、性決定経路の開始と細胞胚盤葉期 24 ～ 39 時間後の fem 転写産物の選択的スプライシングにより、glu 遺伝子は雌特異的スプライシングを示しました。男性特異的な転写物は、Femタンパク質を介したスプライシングを介して女性が決定する状態に切り替わるデフォルトの制御状態です。まとめると、これらの結果は、glu 遺伝子が転写物の性特異的スプライシングを介して 2 つの活性状態を持つ遺伝子スイッチとして機能することを証明します。これらの転写物は、女性と男性で異なるタンパク質活性を発現する可能性があります。

a さまざまな胚段階における性特異的な glu 転写物：細胞化と胚盤葉の開始（産卵後 0 ～ 15 時間）、胚盤葉および原腸形成期の終わり（25 ～ 40 時間）、幼虫の完成（55 ～ 70 時間）69。半定量的 RT-PCR を胚のプールに対して実行しました。 b 蛹期4の雄と雌、および生後10日の雄と雌の成体におけるgluFの組織特異的発現。半定量的 RT-PCR の結果は、ef1α 転写レベルを基準として使用してサンプル間で調整されました。腹部サンプルには生殖腺と神経節が含まれていません。 3 つの生物学的複製を実施しました。蛹および成体の gluM 転写物は増幅されませんでした (補足図 4)。 F：女性。 M：男性。 ef1α：伸び率1α。 C: PCR のネガティブコントロール。

次に、glu 遺伝子が組織特異的に転写されるかどうかを調べました。これは、一般的な身体パターン形成の発生プログラミングによって制御される glu 遺伝子の領域特異的発現を示すものと考えられます。赤目の蛹の段階（ステージ4）では、3つの複製すべての脳（複雑な目の組織を含む）、生殖腺、後肢でgluF（雌）転写物が確実に検出されました（図4b）が、他の複製では検出されませんでした。組織を調べた。成体のミツバチのメスでは、gluFが脳、腹部、触角、後肢で発現していることがわかりました（図4b）。成虫のミツバチの胸部や頭嚢では gluF 発現は検出されませんでした。興味深いことに、蛹と成体で男性のバリアントを確実に増幅することはできず（補足図3）、これは男性の転写産物が存在しないことを示唆しています。我々は、男性特異的な転写物は遺伝子スイッチの非活性状態を表していると結論づけた。雄の fem 転写物も蛹には欠如しているため 26、初期の終止コドンが雄特異的な gluM および femM 転写物のナンセンス媒介崩壊を誘導する可能性があります 31。まとめると、これらの結果は、glu 遺伝子が領域および性別に特異的な遺伝子スイッチであり、特定の組織において一方の性別のみに限定された活性を提供できることを示しています。

性特異的にスプライシングされた glu 遺伝子が性的二型の発生制御因子であるかどうかを理解するために、CRISPR/Cas9 法を使用して雌胚の glu を変異させ、幼虫をワーカー栄養で蛹期まで飼育し、両方の条件が一致する非モザイク個体をスクリーニングした。対立遺伝子は、アンプリコンのディープシークエンシングを使用して変異されました 21,29。エクソン2からエクソン8の欠失（glu Δex2-8 / Δex2-8、sgRNA1および3）のホモ接合性の遺伝的女性は、男性のように背側が伸展した大きな目を発達させました（矢印、図5a）。彼らの相対的な複眼の長さと幅は有意に大きかったが、複眼の相対的な眼間距離は野生型メスと比較して有意に短かった（図５ｃ）。これらの結果は、女性の特徴が部分的に失われ、男性の特徴が部分的に獲得されたことを示しています。外部の身体形態および生殖器官の他の性的二形特性（実体顕微鏡検出レベルまで）は野生型メスのものと同じでした（補足図4）。これは、gluFの全体的な発生機能が体の領域に限定されているということを示唆しています。複眼。 glu 遺伝子が一般的な発生特性ではなく女性特有の特徴を調節しているかどうかを理解するために、我々は特にタンパク質の女性に限定された部分を侵害しました。 sgRNA 10 を使用してエクソン 8 に終止コドンを導入し、女性特異的な CCHH ZnF モチーフと最後の 254 ～ 291 アミノ酸が発現されないようにしました。 glu ex8stop/ex8stopの女性はglu Δex2-8/Δex2-8の女性と同じ表現型を示しましたが（有意差はありませんでした）、相対的な目の幅、長さ、眼間距離に対する影響が再び見つかりました（図5a- c)。この結果は、gluF 転写物が性的二型性の眼の発達の発達調節因子をコードしていることを示しています。次に、雄の蛹や成体では発現が欠如しているにもかかわらず、gluM 転写物が雄の特徴に必要であるかどうかを調べたいと考えました。しかし、この仮説を検証することはできませんでした。なぜなら、蛹対照雄の飼育は（同程度の卵数にもかかわらず）すでに失敗しており、このことは私たちの飼育手順が雄に簡単に適用できないことを示唆しているからです。

a 蛹期4（赤目期）の雌のglu Δex2-8 / Δex2-8（n = 10）およびglu ex8stop / ex8stop（n = 5）変異体の頭部形態。矢印の頭は、男性のような複眼の背側拡張部を示しています。 b 導入された DNA 変異と予想されるタンパク質生成物が概略的に示されています。 c 相対的な目の幅: 頭の幅に対する目の幅。相対的な目の長さ: 頭の長さに対する目の長さ。相対眼間距離：頭の幅に対する眼間距離（両側マン・ホイットニー U 検定）。平均値と標準偏差が表示されます。 d 男性におけるglu ex7-8 F変異の生成の概略図。 e 成人期の女性化glu ex7-8 F雄（n = 9）の頭部形態。矢印の頭は、変異体雄における背側閉鎖の減少を示しています。 f 背側水晶体ファセット直径、両側マン・ホイットニー U 検定。平均値と標準偏差が表示されます。重量：野生型。

女性特有のコード配列が不可欠であることを示したので、次に、複眼の構造全体を女性化するだけで十分かどうかを尋ねました。イントロン7配列を削除し、CRISPR / Cas9媒介相同性指向修復を使用してエクソン7/8配列を融合し、男性に存在するglu転写物が女性特異的なGluタンパク質のみをコードするようにしました（図5d、sgRNA 3および7）。これらのglu ex7-8 F（半数体）雄の目は、正面図では小さく（図5e）、目の背側の閉鎖はそれほど顕著ではありませんでした（矢印、図5e）。これは、雄からの部分的なシフトを示しています目の構造全体に影響を与える女性の目の形態。次に、複眼の背側水晶体面が女性化しているかどうかを尋ねました。ミツバチの背側水晶体小面のサイズは極めて性的二形的であり、複眼全体の性特異的なサイズの違いに寄与しています 23,24。より大きな雄のファセットはより高い光感受性を示し、雄の交尾飛行中に雄蜂や女王蜂を発見するための適応を表します。 glu ex7-8 F雄の背側水晶体小面が実質的に女性化されており（p < 0.001、図5f）、野生型雌と比較してサイズがほぼ全体的に変化していることがわかりました。これらの結果は、glu ex7-8 F コード配列が眼の形態の女性化を指示するのに十分であることを示唆しています。しかし、観察された女性化は部分的であり、少なくとも別の遺伝子が性的二形性の目の分化にも関与していることを示唆しています。

発生の特徴を形成する主要な調節因子は、多くの場合、複数の下流遺伝子と末端細胞の特徴を調節する転写因子 (TF) です。 TF は、CCHH ジンクフィンガードメインなどの DNA 結合ドメインによって特徴付けられます 28、32、33。 Glu の女性特異的な CCHH ZnF モチーフが TF の可能性の重要な要素であるかどうかを調べるために、このモチーフの重要な位置を変更し 34,35,36 、性的二型性の目の発達におけるその役割を研究しました。非遺伝子モデルでそのようなモチーフの機能を確認することは、これまで困難でした。ここでは、女性における可能性のあるZnF構造を破壊することを目的として、CRISPR / Cas9媒介相同性指向修復を利用して、コアZnFモチーフのシステインとヒスチジンをコードするヌクレオチドをアラニンをコードするヌクレオチドに置き換えました（図6a）。。ホモ接合性二重変異体（glu tmC2H2/tmC2H2）は、対照と比較して、有意に長い相対眼長（p < 0.05）、やや短い眼間距離（p = 0.06）、および同じ眼幅を示しました（図6b、c）。性的二型発達におけるこのモチーフの機能。さらに、ヘテロ接合型 glu tmC2H2/tmC2H2 と glu Δex2-8/Δex2-8 の中間的な表現型を示す、ヘテロ接合型 glu tmC2H2/ex8stop 雌 (1 つの対立遺伝子が機能喪失型対立遺伝子を持つ) は女性の特徴のより大きな部分的喪失を示しました。変異体（図6b、c）。これらの結果は、性的二形性の眼の発達におけるCCHHモチーフの役割を実証しており、glu遺伝子が女性特異的な転写因子をコードしているという考えを裏付けている。ただし、目の幅は CCHH 変異の影響を受けませんでした。 ZnF タイプの発生調節因子は通常、複数の ZnF ドメインを持っているため 28,36、次に、メスの Glu タンパク質が他の ZnF モチーフを含むかどうかを調べました。 CCHH ZnFモチーフの周囲に位置する非標準タイプの他の3つの考えられるZnFモチーフを見つけました（補足図5）。これは、追加のDNA結合ドメインの可能性を示しています。

CRISPR/Cas9媒介相同性修復を介して誘発されたtmC2H2変異のスキーム。 CCHH ZnF コアモチーフ C-X2-4-C-X12-H-X3-5-H34,35,36 を、野生型 (wt) および tmC2H2 対立遺伝子の対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列とともに示します。赤い文字は、コア CCHH モチーフのコドンとアミノ酸を示します。サイレント変異は、sgRNA が標的部位にさらに結合するのを防ぎます。下線付きの配列: sgRNA 10 および 9 のターゲット。C: システイン、H: ヒスチジン、A: アラニン。 b 蛹期4のglu tmC2H2/tmC2H2 (n = 10) およびglu tmC2H2/ex8stop (n = 6) 変異体メスの目の形態。ZnFコード配列の周囲のアミノ酸が示されています。ジンクフィンガーモジュール (ZnF) は黄色で強調表示され、コアモチーフの誘導されたアミノ酸変化は赤色で示されます。 c 変異体の目の相対的なサイズと位置（片側マンホイットニー U 検定）。平均値と標準偏差が表示されます。

性二型分化の性特異的発生制御因子としての glu の機能は他の種では記載されていないため、この機能が新たに進化したかどうかを調べた。この遺伝子の進化の歴史についての洞察を得るために、我々は最初に、主要な昆虫系統に由来する種におけるgluホモログの性特異的発現を調べた（補足図6）。双翅目昆虫 D. melanogaster、甲虫 Tribolium Castaneum、および半翅目昆虫 Cimex lectularius (トコジラミ) では、glu ホモログは性特異的にスプライスまたは転写されませんでした (図 7a)。ただし、膜翅目タマバチ Nasonia vitripennis では、glu ホモログ（Nv-glu）の転写物は、雌特有の転写物および雌と雄に共通の転写物と性特異的にスプライスされました（図7aおよび補足図6）。。次に、タマバチにおけるこの性特異的スプライシングが、ミツバチの fem 遺伝子のオルソログである tra 遺伝子によって制御されているかどうかを調べました。全身RNAiを使用したN. vitripennis雌におけるtra遺伝子のノックダウンは、gfp dsRNA処理対照と比較して、雌特異的Nv-glu転写物の減少および共通転写物の大幅な増加をもたらした（図7b）。この結果は、tra 遺伝子が N. vitripennis における glu オルソログの雌特異的スプライシングを (直接的または間接的に) 制御していることを示唆しています。我々は、これらの結果の最大限の倹約推論から、fem/traによるgluの性特異的スプライシングが膜翅目の昆虫系統で進化的に出現したと結論付ける。

性特異的なスプライス制御は膜翅目系統で進化した。 D. melanogaster (CG12316)、C. lectularius (LOC106661925)、T. Castaneum (LOC103312333) および N. vitripennis (Nv-glu) における glu オルソログのスプライシング。ミツバチのエクソン 7/8 と相同な配列が研究されました。半定量的 RT-PCR の結果は、C. lectularius (Cl-ef1α) および T. Castaneum (Tc-ef1α) の ef1α (伸長因子 1α) 転写物、および D. melanogaster のリボソームタンパク質 L38 (RPL38) を使用して、3 つの生物学的複製にわたって調整されました。 N. vitripennis の Nv-gluF は女性に特異的にスプライスされ、女性に特異的なペプチドをコードしますが、Nv-gluC は両性に共通です。 Nv-gluDNA は増幅されたゲノム配列です。 b N. vitripennis における Nv-glu の性特異的スプライシングは、tra 遺伝子によって制御されます。 tra 遺伝子のノックダウンは全身 RNAi によって媒介されました。 dsRNA：二本鎖RNA。 Gfp: コントロール dsRNA。 RT-PCR の結果は、Nv-ef1α 転写物を使用して、治療後 3、4、および 5 日 (d) 後に収集した 3 つのプールにわたって半定量的に調整されました。 C: PCR のネガティブコントロール。 c メス特異的な CCHH ZnF モチーフは進化的に膜翅目の昆虫に由来します。 glu ホモログのアミノ酸配列アラインメントと対応する種の系統発生的関係。主要な進化系統と 49 の膜翅目配列の代表例を補足図 7 に示します。系統関係と進化的分岐時間は Peters et al.70 に従います。赤い小さなボックス: コアモチーフのアミノ酸。灰色のボックス: 疎水性コア残留物。ノードの横にある % 値: 倹約法に従って推定される変更の可能性。 d N. vitripennis の glu ホモログは、性特異的な眼の分化には関与しません。全身RNAiによるNv-glu遺伝子ノックダウンに応答したN. vitripennisの雄と雌の性特異的な眼の分化。幼虫の注射とdsRNA処理のみが成体の頭の一般的なサイズに影響を与えるため、相対的な目のパラメーターではなく絶対的な目のパラメーターが表示されます（補足図9）。比較のために、ミツバチの絶対値と有意値が提供されています（補足図10）。平均値と標準偏差が表示されます。

私たちの突然変異研究により、メス特異的な CCHH ZnF モチーフがミツバチの複眼の性的二形性分化の重要な要素であることが明らかになりました。 CCHH ZnFモチーフがアミノ酸置換によって新たに生じたかどうか（たとえばキイロショウジョウバエには存在しない）を判断するために、一連のgluから最大節約法を使用してアミノ酸の異なる祖先状態の可能性を推測しました。 49 膜翅目種の相同配列。特定された祖先の状態は、CCHH ZnFモチーフが、タマバチN. vitripennisを含む寄生蜂系統から分岐した後のAcleata系統内に由来することを示唆しています（図7cおよび補足図7）。我々は、CCHH ZnFモチーフが、祖先の状態と49の配列の系統発生から再構成できる一連の変化を介して進化したことを発見しました（図7cおよび補足図7）。進化的変化の順序は次のとおりです。(i) 挿入/欠失による 2 番目のシステインと 2 番目のヒスチジンの間に必要な間隔の獲得。 (ii) 点突然変異による、標準モチーフのコア残基である疎水性アミノ酸イソロイシン (I) の獲得 28,36。 (iii) アミノ酸ヒスチジン (H) の獲得により、CCHH ZnF モチーフが完成しました。これらの結果は、CCHH ZnF モチーフがコード配列における一連の突然変異を介して新たに進化したことを示唆しています。

D. melanogaster (CG12316) の glu ホモログは性特異的にスプライシングされておらず、注釈付きの表現型もありません 40,41,42 ため、性特異的な発生制御因子としての glu の機能が新たに進化したのかどうかという疑問が生じています。この機能の進化的起源に関する証拠を得るために、全身RNAiを使用してN. vitripennisにおけるNv-gluの役割を調べました（補足図8）。 Nv-glu は、CCHH ZnF モチーフがまだ存在しない間に性特異的なスプライシングが獲得された、過去の可能な中間進化状態を表している可能性があるため、N. vitripennis でのこの研究はその点で有益でした。さらに、N.vitripennis では男性と女性の眼間距離が性的に二形であることが以前に示されています 18。複眼の幅、長さ、眼内距離は、女性と男性の両方において、Nv-gluノックダウン個体と対照個体の間で差異がありませんでした（図7d）。全身的な RNAi 実験から得られたこれらの結果は、Nv-glu 遺伝子がジュウバチの性的二型性の眼の分化を制御していないことを示唆しています。これらの比較結果を総合すると、性的二形性の眼の発達の制御因子としてのグルタミン酸の役割が膜翅目昆虫内で最近進化し、これがミツバチにつながる系統内で進化したという結論に達した。

発生生物学者の中心的な関心は、性決定シグナルが一般的な発生プログラムとどのように統合されているかを理解することです。性間の違いは多様である可能性があり、性的二型は生物間で驚くほど多様であり、急速な分岐を示唆しているため、これは特に興味深い問題です。我々は今回、glu遺伝子を用いて性的発達のもう一つの制御因子を特徴づけ、その制御の分子機構を解明し、性的二型構造がどのように形成されるかについてのさらなる理解を提供した。

私たちは、ミツバチの性的二型性の眼の分化が、これまで報告されていなかった性特異的な発生制御因子である glu 遺伝子によって部分的に制御されていることを示しました。 glu 遺伝子は、性特異的な遺伝子スイッチとして機能します (図 8a)。性特異的な活性は、女性および男性に特異的な転写スプライシングによって提供され、これは tra 遺伝子のオルソログである fem 遺伝子によって制御されます 25,26。 Femタンパク質は女性に限定されており、エクソン8の選択的スプライスアクセプター部位の使用を指示します。これらの女性特異的転写物は、ZnFドメインを持つGluFタンパク質（1466～1572アミノ酸）をコードします。男性にFemタンパク質が存在しない場合、エクソン8の別のスプライスアクセプター部位が利用され、glu転写物に初期停止コドンが生成されます。 ZnF ドメインを持たない予測された雄タンパク質は、226 ～ 332 アミノ酸の長さです。しかし、雄の蛹および成体には glu 転写物が存在しないことは、雄のスプライスされた転写物には機能がないことを示唆しています。おそらく、この転写物の欠如は初期の停止コドンによるものであり、これにより転写物のナンセンス媒介減衰が誘発される可能性があります 31。私たちの機能研究によると、この遺伝子スイッチの最も明白な制御は、女性特異的な ZnF ドメイン含有タンパク質 (GluF) の発現が女性のみに活性をもたらすことです。男性の転写物は、機能しないタンパク質を生成するか、タンパク質を生成しません。

a メスミツバチの性的二型分化における glu 遺伝子と dsx 遺伝子の領域特異的役割。 b 性的二型分化のための遺伝子スイッチを引き起こす一連の進化段階。ボックスはエクソンを示します。 ORF の女性特有の部分は赤で表示され、男性特有の部分は青で表示され、共通部分は濃い灰色で表示されます。ジンクフィンガーモチーフ (ZnF) は黄色で示されています。

GluFタンパク質は、おそらくZnFドメインタイプの転写因子であり、目の形態の女性化を調節します（図8a）。男性特異的な分化は、この遺伝子スイッチの制御上のデフォルト状態によって引き起こされます。私たちの研究は、さまざまな程度の性間表現型を示し、gluFが全体的な性的な目の構造の調節に部分的にのみ関与し、主に性的二形性の水晶体小面サイズに関与していることを示唆しています。これは、性特異的に調節される他の遺伝子が性的二型性の目の分化の形成に関与しているに違いないことを示唆しています。これは、他の性的に調節された発生遺伝子や、眼の大きさや形に影響を与える細胞増殖などの一般的な機能を持つ遺伝子である可能性があります。幹細胞の性特異的な増殖はショウジョウバエで実証されており、これが女性の中腸器官の大型化に関与しています43。

これまでの研究では、DM ドメイン遺伝子が性特異的発生の中心的な保存された制御因子であることが示されています。さまざまな動物門のDMドメイン遺伝子相同体は、C. elegansの尾の形態6,7、甲殻類D. magnaの雄特有のアンテナと交尾胸部フック8、D. melanogasterの性櫛9,10などの外部性的形態を指示する。そしていくつかの甲虫の誇張された角の構造11、12、13。これにより、DM ドメイン遺伝子は、男性と女性で異なる活性を生み出す性別特異的な遺伝子スイッチとして機能します。昆虫では、性特異的な活動はスプライシングによって確立されます。多くの昆虫では、fem/tra 相同遺伝子によって媒介されるスプライシングにより、共通の DM ドメインを持つが C 末端が異なる性特異的な Dsx タンパク質が発現します 3,44,45。

2 つの中心的な疑問は、(i) DM ドメイン遺伝子がさまざまな身体部分の性特異的構造をどのように指示できるか、および (ii) 広く保存されている DM 遺伝子が、動物系統には以前は存在しなかった新しく進化した性的二型構造の形成をどのように指示できるかということです。 2 つのメカニズムが示唆されています。これらは主に昆虫およびショウジョウバエ属の dsx 遺伝子に焦点を当てた研究から生じたものです 2,10,12,46,47,48,49,50。体のさまざまな部分の性的二形構造を説明するメカニズムは、dsx 遺伝子の局所的発現が領域特異的な性的指示を提供することを示唆しています。たとえば、雄特有の性櫛はショウジョウバエの前肢に限定されており、その組織における局所的な dsx 発現によって誘導されます 9,10。新しい性的二型の進化的起源を説明するメカニズムは、dsx標的遺伝子のシス調節要素の進化的獲得と修飾が、新しい特徴に対する遺伝子調節の変化を確立することを示唆している46,51。例えば、キイロショウジョウバエの雄における腹部体の色素沈着の拡大は、これらのシス調節要素の進化的獲得および改変から進化する可能性がある46,51。

gluに関する我々の研究結果は、性特異的二形性の局所的形成と進化的起源の根底にある他のメカニズムを示唆している。私たちは、ミツバチのグルタミン酸が、組織特異的に発現され、目の女性化を選択的に制御する、新たに進化した性特異的な発生調節因子であることを示しました（図8）。ミツバチでは、dsx は性生殖器官の発達 21 を制御しますが、頭や目の性分化は制御しません (補足図 1)。これらの結果は、体の異なる部分における性的二型が、異なる性特異的な発達調節因子（gluおよびdsx）によって調節されるメカニズムを示唆している。それらは並行して動作しますが、組織特異的な発現を介して体の異なる領域で動作します（図8a）。さらに、glu の機能の進化は、性的二型構造の起源の可能性の根底にある進化メカニズムへの洞察も提供しました。我々は、性特異的発現の進化的起源（性特異的スプライシングの獲得による）と分子機能の獲得（ZnFモチーフの起源による）が、性的二型に対する新たな性特異的な発生制御因子につながることを示した。

性的二形形質の起源は依然として進化生物学の中心的な問題である。二形構造に対するこのような新しい性特異的規制がどのようにして生じるのかという疑問は残っている。 glu 遺伝子の機能および配列の比較研究は、この機能が一連の 2 つのステップで発生したことを示唆しています (図 8b)。最初のステップでは、glu が性決定経路に動員され、性特異的な遺伝子スイッチと発現が確立されました。我々は、この性特異的制御の獲得が、glu転写物に対するfem依存性のスプライス制御の起源を介して実証された。これはおそらく膜翅目系統が他の主要な昆虫系統から分かれた後に起こったものであると考えられる。 2番目以降のステップでは、glu遺伝子は膜翅目昆虫内で性特異的な眼分化機能を獲得し、これがミツバチにつながる系統内で獲得されました（図8b）。 Nasonia 属では dsx が男性の頭のパターン形成と目のサイズに関与していることが以前に示されていますが、N.vitripennis では glu が目のサイズに影響を与えないことが示されました。さらに、ZnFモチーフの進化と機能を調べることにより、性特異的な眼の分化に対するこのドメインの役割が、性特異的な発現の獲得後に新たに進化したことを実証した。

これらの変化の順序は、進化の過程で新しい性的二形構造がどのように生じるのかについての洞察を提供します。我々は、理論によって長い間予測されてきたが、我々の知る限り実証されていない、一連の進化的変化（性特異的発現の獲得とそれに続く性特異的発生機能の起源）を観察した。私たちは、gluの性特異的発現の進化的獲得が、メスタンパク質のコード配列に対するいくつかの突然変異を限定する最初のステップであることを発見した。さらに、雌コード配列におけるこれらの変異が、雌に限定された発生機能を持つ新しい ZnF モチーフの形成に関与していることを実証しました。したがって、我々の発見は、性特異的発現の獲得が、性的二型の新たな発生調節因子が進化的に生じ得る分子経路であることを実証している。

この研究で使用されたミツバチは、野生のセイヨウミツバチのコロニーに由来しました。雌の胚（二倍体）は、自然交配した女王蜂が産んだ卵から収集されました。一倍体雄の卵は、未受精卵の産卵を誘発するCO2で処理された非交配女王蜂から収集されました。胚は、ジェンター採卵ボックス (Jenter Queen Rearing Kit、Karl Jenter GmbH、フリッケンハウゼン、ドイツ) を使用して収集され、注入されるか、または目標段階まで 34 °C の保育器内に放置されました 55。野生型の蛹と成虫をミツバチのコロニーから収集しました。野生型 Cimex lectularius の成体雄と雌は、Insect Services GmbH (ベルリン、ドイツ) から購入しました。同質遺伝子株 w1118 由来のキイロショウジョウバエ成虫は、Hermann Aberle (ハインリッヒハイネ大学デュッセルドルフ、ドイツ) から寄贈されました。 Tribolium Castaneum の成虫の雄と雌は、Gregor Bucher (ドイツ、ゲッティンゲン大学) から寄贈されました。実験室用の Nasonia vitripennis の AsymCx 株は、Wolbachia 感染を治癒し、Calliphora sp. で継続的に飼育されました。ホストは 25 °C です。オスとメスのスズメバチは、羽化前の性別固有の前翅サイズに基づいて区別されました。雄だけの子孫は、処女の雌に宿主を提供することによって生成されました。雌の子孫を生み出すために、処女の雌を一頭の雄とペアにし、1日交尾させた。産卵を開始するために、1 日あたり 2 匹の宿主を個々のメスに提供しました。

innuPREP DNA Mini キット (Analytik Jena、イエナ、ドイツ) を使用して、ミツバチ L1 幼虫、女王脚、または蛹の後脚組織からゲノム DNA を単離しました。解剖したミツバチの組織およびキイロショウジョウバエ、T. カスタネウム、または C. レクチュラリウスの成虫 (男女各 3 匹のプール) からの RNA を、TRIzol 法 (Thermo Fisher Scientific、ブラウンシュヴァイク、ドイツ) を使用して単離しました。幼虫ステージ 1、胚、または胚のプールからの RNA を、innuPREP DNA/RNA Mini キット (Analytik Jena、イエナ、ドイツ) を使用して単離しました。 cDNAは、RevertAid First Strand cDNA合成キットおよびオリゴdTまたはランダムヘキサマープライマー（Thermo Fisher Scientific、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）を使用して合成しました。続いて、DNA Polymerase I21を用いて第2鎖を合成した。 cDNAの精製は、EZNA Cycle Pureキット(Omega Bio-Tek. Inc.、ノークロス、米国)を使用して実施した。オンカラム DNase I 処理 (Thermo Fisher Scientific、ブラウンシュヴァイク、ドイツ) を備えた ZR Tissue & Insect RNA MicroPrep™ (Zymo Research、フライブルク、ドイツ) を使用して、N. vitripennis からの RNA を抽出しました。この場合、cDNA は SensiFAST™ cDNA 合成キット (Bioline, London, England) を使用して合成されました。

続いてアンプリコンの配列を決定する場合、RT-PCR には Phusion™ High-Fidelity DNA ポリメラーゼ (Thermo Fisher Scientific、ブラウンシュヴァイク、ドイツ) を使用しました。それ以外の場合は、GoTaq® G2 Flexi DNA ポリメラーゼ (Promega、ヴァルドルフ、ドイツ) を使用しました。 PCR は標準温度プロファイルで実行されました 56。半定量的 RT-PCR では、参照遺伝子伸長因子 1-α (Nv-ef1α、N. vitripennis、Cl-ef1α、C. lectularius、ef1α、A. mellifera) に従ってテンプレートの量とサイクル数を調整しました。およびリボソームタンパク質 L32 (RPL32; D. melanogaster) を使用して飽和を除外し、サンプル間の調整を可能にします。使用したオリゴヌクレオチド (Eurofins Genomics、Ebersberg、ドイツ) とその配列は補足データ 1 にリストされています。アガロースゲルのトリミングおよび未処理のスキャンは、ソースデータファイルで提供されます。

A. mellifera の glu (LOC552468) のエクソン構造は、RNAseq データ 27 と、生後 25 ～ 40 時間のオスおよびメスのミツバチの胚およびメスの蛹の脳組織に由来する RNA を使用して RT-PCR によって得られたアンプリコン配列を使用して決定されました。ドメイン検索は、PROSITE (https://prosite.expasy.org/)57、InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)58、および Pfam データベース (https://pfam. xfam.org)59. 相同タンパク質は、NCBI データベースの BLASTP 検索によって有意な類似性を伴って同定されました (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。同定された遺伝子は、LOC100678462 (Nv-glu; N. vitripennis)、LOC106661925 (C. lectularius)、LOC103312333 (T. Castaneum) および CG12316 (D. melanogaster) でした。コードエクソンの相同な位置と考えられる境界は、タンパク質配列を使用することによって推定されました。祖先の状態は、最大倹約法を使用して推定されました60。 MEGA661を用いて進化配列解析を行った。図７ｃに示される配列は以下の通りである：Ａ．メリフェラＸＰ＿０２６２９９６９５．１；Ａ．セイヨウオオマルハナバチ XP_012165493.2; ユーフリーシーメキシカーナ OAD55885.1; メガチリロタンダ XP_012146010.1; Acromyrmex エキナティオール XP_011060010.1; アシナガバチカナデンシス XP_014601325.1; N. ビトリペニス XP_003425013.1; フォピウス・アリサヌス XP_011314024.1; オルススアビエンティヌス XP_012279333.1; Cephus cinctus XP_015598325.1; ネオディプリオン・ルコンテイ XP_015517082.1。

sgRNA の標的部位は Benchling ソフトウェア (https://benchling.com/) で特定されました。標的部位は 20 nt 長で、5' グアニジンで始まり、ゲノム内の別の標的に対して少なくとも 3 つのミスマッチ (オフターゲットの可能性) を示しました。 PCR により、T7 RNA ポリメラーゼ転写開始部位、標的配列、および Cas9 タンパク質結合配列を含む DNA フラグメントが生成されました。 sgRNA (補足データ 1 に記載の配列) は、鋳型として DNA 断片と RiboMax キット (Promega、ヴァルドルフ、ドイツ) を使用して合成されました。 MEGAclear Kit (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Germany) を使用して sgRNA を精製し、500 ng/μl Cas9 タンパク質 (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Germany) とモル比 2:1 で混合しました。標的変異の場合、400 μl の注入混合物あたり 15 ～ 20 pg の dsDNA を追加しました。ｄｓＤＮＡは、２５０ｂｐの隣接相同配列を有する提供された配列（ＥｕｒｏｆｉｎｓＧｅｎｏｍｉｃｓ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って生成された。配列は、注射前にＰＣＲによって増幅され、ＥＺＮＡＣｙｃｌｅＰｕｒｅキット（ＯｍｅｇａＢｉｏ－ＴｅｋＩｎｃ．、ジョージア州ノークロス）を使用して精製された。ミツバチの胚 (生後 0 ～ 1.5 時間) に 400 μl の sgRNA/Cas9 混合物を注入し、幼虫が孵化するまでインキュベーター内に保管しました 55,62。幼虫の飼育は、幼虫が発生するまで 34 °C、湿度 94% で 170 mg の労働者食餌 (滅菌水中 w/v: 50% ローヤルゼリー、15% グルコース、15% 乳糖、1% 酵母エキス)63 を与えて行われました。幼虫をろ紙を備えたペトリ皿に移し、蛹の第 4 段階まで 34 °C、湿度 75% で維持しました 64。 glu ex7-8 F 雄の分析では、注射された雌幼虫を女王まで育て、雄の産卵は処女女王の CO2 処理によって誘導されました 55。羽化後に雄の子孫を収集し、若い働きバチと一緒に保育器内の小さな巣箱に保管しました。表現型検査は、羽化後 1 ～ 16 日後に成体雄に対して行われました。注射された個体は、所望の突然変異についてスクリーニングされた。変異の標的部位が増幅されました (glu 遺伝子の DNA および fem 遺伝子の cDNA; 補足データ 1)21。最初のステップでは、アンプリコンの長さの違いを使用して個体を事前にスクリーニングしました。 glu Δex2-8/Δex2-8 欠失および glu ex7-8 F 変異を持つ個体は、ゲル電気泳動によるアンプリコンの分離によって同定されました。他の変異については、PCR21 用のヘキサクロロフルオレセイン標識プライマーを使用したキャピラリーゲル電気泳動によって断片長分析を実行しました。 glu ex7-8 F の変異は、ヌクレオチド配列決定によってさらに検証されました。我々は、酵素 PdiI (Thermo Fisher Scientific、ブラウンシュヴァイク、ドイツ) によるアンプリコンの制限消化およびゲル電気泳動によって、glu tmC2H2 変異を同定しました。検出された長さの変異は、アンプリコンの DNAseq によって得られたヌクレオチド配列に基づいてさらに検証されました。 Nextera XT Index Kit (Illumina、サンディエゴ、米国) を使用してインデックス PCR を実行し、Agencourt AMPure XP ビーズ (Beckman Coulter、ブレア、米国) でアンプリコンを精製しました。 MiSeq Reagent Kit v2 (500 サイクル; Illumina、サンディエゴ、米国) を使用したライブラリーの調製とシーケンス (2 × 250 bp リード) は、Illumina に続いて生物医学研究センター (BMFZ、ハインリッヒハイネ大学、ドイツ) によって実行されました。プロトコル。 Illumina MiSeq システム (Illumina、サンシエゴ、米国) では、サンプルあたり最低 78,000 リードが生成されました。生の配列は、Galaxy オンラインツールセット (http://usegalaxy.com)65 を使用して処理および分析されました。無関係な存在量の少ない配列 (リードの 5% 未満) は除外されました 21。

MEGAscript RNAi キット (Thermo Fisher Scientific、ブラウンシュヴァイク、ドイツ) を使用して、dsRNA (traF、Nv-glu、gfp: 緑色蛍光タンパク質由来の配列) を生成しました。 Nv-glu dsRNA は、雌雄両方に存在する転写産物の共通部分を標的としました。 gfp 配列は、Ray Owens から贈られたベクター pOPINEneo-3C-GFP から増幅されました (Addgene プラスミド # 53534; http://n2t.net/addgene:53534; RRID: Addgene_53534)。 dsRNA Nv-traF を 4 齢の雌幼虫に注射し、dsRNA Nv-glu を 2 齢の雄と雌の幼虫にそれぞれ 4000 ng/μl の濃度で注射しました。食用色素を dsRNA 溶液 (1:9 v/v) に添加して、注入をガイドしました。 N. vitripennis larvae66 への注射は、FemtoJet® 4i インジェクター (Eppendorf, Hamburg, Germany) を使用して実行されました。注射された 2 齢幼虫を、1X PBS プレート上に配置されたその里親宿主 (宿主あたり 6 ～ 8 匹の幼虫) に移しました 66。 dsRNA Nv-traF 処理サンプルを注射の 3、4、および 5 日後に収集し、プールしました (n = 4 ～ 5)。表現型解析のために、dsRNA Nv-glu サンプルを成体段階で収集しました。

qRT-PCR は、SensiFASTTM SYBR® No-ROX キット (Bioline、ロンドン、英国) の手順に従って、CFX96TM リアルタイムシステム (Bio–Rad、米国ハーキュリーズ) で 3 ～ 7 回の反復で実行されました。 Nv-glu qPCR プライマーは、dsRNA 標的領域の外側に設計されました。値は、CFX Manager 3.1 ソフトウェア (Bio–Rad、Hercules、USA) を使用して分析されました。

相対発現レベルは、LinRegPCR ソフトウェア (LinRegPCR、2017.1.0.0、HFRC、アムステルダム、オランダ) を使用して計算されました67。 Nv-glu ノックダウンは 2 つの別々の実験で実行されました (補足図 8)。

ミツバチの蛹から頭部を解剖し、UI-1240LE-C-HQ カメラ (IDS、オーバーズルム、ドイツ) および uEye Cockpit (IDS スイート v4.92 の一部) を備えた S8 APO 双眼顕微鏡 (Leica、Wetzlar、ドイツ) を使用して写真を撮影しました。 IDS、オーバーズルム、ドイツ）ソフトウェア。背側レンズ面直径測定用の画像は、Canon Eos 6d Mark II カメラと Canon MP-E65 mm 1:2,8 1–5x Marco 対物レンズ (東京、日本) を使用して撮影されました。 N. vitripennis 成体頭部の画像は、Dino-Lite Edge 5MP デジタルマイクロスコープおよび DinoCapture 2.0 ソフトウェア (Dino-Lite、アルメレ、オランダ) を使用して取得しました。頭のパラメータ（頭の幅、頭の長さ、目の幅、目の長さ、眼間距離）は、概略的に示されているように測定されました（補足図11）。 glu ex7-8 F 男性および対照では、水晶体小面の直径は、男性の小面が最大であるはずの眼の前頭背側領域で測定されました 24。個人ごとにランダムに測定された 15 個のレンズ面直径の平均が分析に使用されました。長さの測定は、ImageJ (米国国立精神衛生研究所) を使用して実行されました。

データ統計分析は、SigmaPlot 14.0 (Systat、米国サンノゼ) を使用して実行されました。表現型データの比較は、両側（または図6cでは片側）マンホイットニーU検定によって分析されました。 N. vitripennis における発現レベルの比較のために、スチューデントの t 検定を適用しました。データのプロットは、平均と標準偏差 (図 5c、f、6c、7d、および補足図 1、9、10) または標準誤差 (補足図 8) を示します。 N. vitripennis のノックダウン表現型データを除き、データは除外されませんでした。このデータでは、注入手順だけで頭部のサイズ表現型に極端な外れ値と変動が生じました (補足図 9)。手順に従って、対照群と治療群の両方からの頭の幅または長さのデータからそのような異常値68を除去するための基準として標準偏差の1.5倍を使用しました（図7dおよび補足図9）。サンプルサイズの計算は行われませんでした。代わりに、サンプルサイズは、ミツバチの発生に関する同様の以前に発表された研究に基づいて選択されました。それぞれの単一の昆虫の表現型は、独立した突然変異またはノックダウンイベントに由来します。これらのデータポイントは、独立した生物学的複製を表します。研究者らは盲目になった。彼らは、表現型解析中にその昆虫が治療/突然変異グループに属するのか、それとも対照グループに属するのかを知りませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

著者らは、論文の結論を確認するために必要なすべてのデータが論文内、図、補足情報およびデータ、またはソースデータファイルに示されていることを確認します。ここで分析された以前に公開された RNA-seq データは、NIH GEO でアクセッション番号 GSE159387 として入手できます。 glu 遺伝子の性特異的 cds 配列は、アクセッションコード OQ116780 および OQ116781 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) としてデータベース NCBI に寄託されました。データベース PROSITE (https://prosite.expasy.org/)57、InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)58、Pfam (https://pfam.xfam.org)59、およびこの研究で使用された NCBI データベースの BLASTP ツール (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) はオンラインでアクセスできます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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ミツバチの取り扱いと分析サポートにご協力いただいた Eva-Maria Theilenberg、Marion Müller-Borg、Maryam Masrouri、Ann-Christin Langen に感謝します。ミツバチのコロニーを提供してくれた Michael Griese に感謝します。複眼のマクロ写真を撮影してくれた Steffen Köhler に感謝します。キイロショウジョウバエは、Hermann Aberle (ドイツ、デュッセルドルフのハインリッヒハイネ大学) から寄贈され、Tribolium Castaneum カブトムシは、Gregor Bucher (ドイツ、ゲッティンゲン大学) から寄贈されました。原稿の初期バージョンに関して非常に有益なコメントをくれたダニエル・ボップに感謝します。アンプリコン配列決定と配列決定の品質管理は、デュッセルドルフ大学 (ドイツ) の生物学・医学研究センター (BMFZ) によって実施されました。ミツバチのプロジェクトは、ドイツ財団 (助成金番号 BE 2194/13-3、BE 2194/10-3; http://www.dfg.de/) によって資金提供されました。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。

ハインリッヒ・ハイネ大学進化遺伝学研究所、デュッセルドルフ、ドイツ

オクサナ・ネスキタイロ、アンナ・ワグナー、ヴィヴィアン・ソマー、マーティン・ベイ

ワーヘニンゲン大学、オランダ、ヴァーヘニンゲン昆虫学研究室

ワン・イードン & エヴリン・C・フェルフルスト

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概念化、ON と MB。方法論、ON と YW。検証、ON および MB。正式な分析、ON および YW。調査、ON、YW、VS、AW。執筆 - 原案、ON および MB。執筆 - レビューと編集、ON、MB、YW、EV。視覚化、オン。監督、EVおよびMB。資金調達、MB

オクサナ・ネスキタイロまたはマーティン・ベイへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Michael Perry、Giuseppe Saccone、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Netschitailo, O.、Wang, Y.、Wagner, A. 他ミツバチの性的二形性の目の分化を制御する遺伝子スイッチの機能と進化。 Nat Commun 14、463 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36153-4

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受信日: 2022 年 1 月 29 日

受理日: 2023 年 1 月 18 日

公開日: 2023 年 1 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36153-4

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