マルハナバチの雄における生体アミンの行動的役割
Scientific Reports volume 12、記事番号: 20946 (2022) この記事を引用
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原始的真社会性ミツバチと高度な真社会性ミツバチの雄における生体アミンの行動的役割を比較するために、脳内のドーパミンおよびオクトパミン関連物質のレベルと、原始的真社会性マルハナバチへの薬物注射によるこれらのモノアミンの行動的影響を測定しました。 、セイヨウオオマルハナバチ。 脳内のドーパミンとその前駆体のレベルは蛹の後期にピークに達しましたが、ドーパミンのピークは成虫の羽化まで延長されました。 チラミンとオクトパミンのレベルは、蛹中期から成体期にかけて増加しました。 運動と飛行の活動、そして軽い好みは年齢とともに増加しました。 オクトパミンとその受容体拮抗薬の注射は、運動活動と飛行活動に大きな影響を及ぼしましたが、ドーパミン注射は影響を及ぼしませんでした。これは、これらの活動がオクトパミン作動性システムによって調節できることを示しています。 また、ミツバチ (Apis mellifera) の蜂体内のドーパミン関連物質の動態も明らかにしました。 ミツバチの雄蜂の脳内のドーパミンレベルの変化は、蛹から成虫の段階で2つのピークを示しましたが、マルハナバチの雄には1つのピークしかありませんでした。 これらは、ミツバチの雄蜂におけるドーパミンの行動機能と、マルハナバチの雄における成虫段階でのドーパミン注入の無効性と一致している。
真社会性は、遺伝的に関連した個体間の役割分担を伴う最も複雑な社会システムであり、広範囲の昆虫分類群のさまざまな種で報告されています1、2、3、4。 真社会性の膜翅目では、コロニーのメンバー間の協力を伴う社会的行動はメスでのみ観察されます。 真社会性の膜翅目のオスは生殖に特化しており、巣の建設、子育て、コロニーの防衛には参加しません 1,2,5 が、真社会性のミツバチのオスはコロニーの体温調節に貢献しています 6,7。 したがって、男性の行動レパートリーは労働者の行動レパートリーよりもはるかに少ないです。 オスの行動とそれに関連する生理学的メカニズムを調査すると、高度に社会的な環境におけるオスの生殖のための行動の特殊化について重要な洞察が得られる可能性があります。
高度な真社会環境におけるミツバチ (Apis mellifera) 雄蜂の行動は、遺伝学、内分泌学、生殖生物学、進化生物学などのさまざまな研究分野で研究されています8。 ミツバチの雄蜂は羽化後 1 週間で性的に成熟し、処女の女王蜂と交尾するために飛び始めます5,9。 ドローンの生殖に関連する運動活動と飛行活動は、性的成熟期の年齢とともに増加します10。 ミツバチの雄蜂は母蜂群に戻りますが、マルハナバチの雄蜂はコロニーの位置を学習せず、決してコロニーに戻りません7、11、12。 マルハナバチのオスは巣を出た後、交尾する雌蜂を探しながら自分で採餌します。 これは、マルハナバチのコロニーの栄養状態が低下するコロニーシーズンの終わりに雄が繁殖するためである可能性があります。 したがって、オスのコロニーへの依存度はミツバチとマルハナバチでは異なり、これは異なる社会環境に対するオスの行動の適応を反映している可能性がある。
生体アミンは、さまざまな昆虫種において神経伝達物質、神経調節物質、神経ホルモンとして機能する生理学的物質です13、14、15、16、17。 これらの物質は、ミツバチの働きバチの年齢に伴う分業 18,19 と処女女王蜂の生殖行動 20,21 に関与しています。 ミツバチの雄蜂では、脳内のドーパミンとオクトパミンのレベルは年齢とともに増加します10、22、23。 これらのモノアミンをドローンの体液に注入すると、ドローンの運動活動と飛行活動が強化されます10,23。 したがって、脳内のドーパミンとオクトパミンのレベルの増加は、ミツバチの雄蜂の配偶飛行活動と密接に関連している可能性があります。 ドーパミンはまた、ミツバチ科の共通の祖先を共有する孤独なミツバチ Xylocopa appendiculata 24 の雄の運動活動と飛行活動を強化します 25。 したがって、生体アミンによる雄の生殖行動の制御は、真社会性のミツバチの間で共有されている可能性があり、シジミミツバチなどの単系統クレード内の他の種でテストされる必要がある。
マルハナバチは原始的な真社会性のミツバチの大規模なグループを構成しており、孤独な真社会性の種と高度な真社会性の種の間のミッシングリンクを調査するのに理想的な種ですが、社会的行動の多次元分析ではミツバチとマルハナバチの社会的複雑さの小さな違いが示唆されています26。 オスのマルハナバチは、晩夏から初秋にかけて、温帯地域で完全に成長したコロニーによって生産されます2,7。 コロニーにおけるマルハナバチの雄の主な役割は生殖であり、単独で交尾するミツバチの雄蜂とは対照的に、異なる雌蜂と交尾することができます。 マルハナバチのオスは羽化後 6 ~ 9 日で性成熟を完了し、雌蜂との交尾を開始します27。 マルハナバチのオスの生殖行動の根底にある生理学的メカニズムを解明し、ミツバチのそれと比較することは、オスの生殖行動の調節システムの社会環境への適応についての理解を促進する可能性があります。 しかし、これまでの研究では、マルハナバチのオスにおける生体アミンによる生殖行動の調節は報告されていません。 そこで、本研究では、脳内の生体アミン濃度の動態と、マルハナバチ (B. ignitus) 雄の生殖行動に対する生体アミンの影響を調査しました。 また、マルハナバチとミツバチのメカニズムを比較して、生体アミンによって媒介されるメカニズムが 2 つの種間で異なるかどうかを確認しました。
我々はまず、電気化学的検出を備えた高速液体クロマトグラフィー(HPLC-ECD)システムを使用して、マルハナバチの雄の蛹と成虫の脳内のドーパミン、オクトパミン、およびそれらの前駆体のレベルを測定しました。 2つのドーパミン前駆体(チロシンとDOPA、図1A)のレベルは、蛹期(P0–1からP6–7)の間、年齢とともに増加しましたが、羽化前(P8–9からA0)に減少し、その後は一定の低いレベルに留まりました。成虫期(A2~A8)と蛹期(チロシン: クラスカル-ウォリス: H = 106.500、df = 9、P < 0.001、スチール-Dwass: P < 0.05、図 1B; DOPA: クラスカル)との比較–Wallis: H = 88.300、df = 9、P < 0.001、Steel-Dwass: P < 0.05、図 1C)。 しかし、ドーパミンレベルは蛹の段階で年齢とともに増加し、蛹の状態の終わり(P8〜9)から成虫の羽化(A0)まで最高レベルに留まり、その後減少(A2〜A8)した(Kruskal-Wallis: H = 88.599、df = 9、P < 0.001、鋼-Dwass: P < 0.05、図 1D)。 ドーパミンレベルの変化は基本的にチロシンおよびドーパレベルの変化と同様であったが、羽化後のドーパミンレベルの減少はドーパミン前駆体の減少に比べて遅れた。
マルハナバチ雄の脳タンパク質によって正規化されたドーパミン関連物質の年齢依存性変化。 (A) ドーパミン関連物質の合成経路。 脳内のチロシン (B)、ドーパ (C)、ドーパミン (D) のレベルが表示されます。 エラーバーは標準誤差を示します。 Steel-Dwass 検定による有意差 (P < 0.05) は、異なる文字で示されています。 サンプルサイズは括弧内に示されています。
チラミンはオクトパミンの前駆体であるチロシンの代謝産物であり、昆虫において独自の機能を持っています 15,28 (図 2A)。 チラミンのレベルは、蛹の段階では一定のままでしたが、蛹の段階の終わり(P8~9)から成虫の羽化(A0)まで増加し、成虫の段階(A0~A8)では蛹の段階よりも高いレベルを維持しました(クラスカル-ワリス: H = 79.481、df = 9、P < 0.001、スチール-Dwass: P < 0.05、図 2B)。 オクトパミンレベルは、蛹期中期(P4〜5)から成体期まで増加しました(Kruskal-Wallis:H = 80.097、df = 9、P < 0.001、Steel-Dwass:P < 0.05、図2C)。 したがって、チロシンに由来する 2 つのフェノールアミン (チラミンとオクトパミン) のレベルは、蛹中期から成体期にかけて年齢とともに徐々に増加しました。
マルハナバチのオスの脳タンパク質によって標準化されたオクトパミン関連物質の年齢依存性変化。 (A) オクトパミン関連物質の合成経路。 チラミン (B) とオクトパミン (C) のレベルが示されています。 エラーバーは標準誤差を示します。 Steel-Dwass 検定による有意差 (P < 0.05) は、異なる文字で示されています。 サンプルサイズは括弧内に示されています。
年齢に伴う行動活動の変化を調査するために、マルハナバチのオスの運動活動と飛行活動をさまざまな年齢で測定しました。 運動活動は A0 から A4 まで大幅に増加し、その後一定の高いレベルを維持しました(Kruskal-Wallis: H = 46.139、df = 4、P < 0.001、Steel-Dwass: P < 0.05、図 3A)。 リング状のチャンバー内を歩いた個人の割合は A0 から A4 まで増加し、A6 と A8 では最大 100% になりました (ボンフェローニ補正を使用したフィッシャーの直接確率検定: P < 0.05、図 3B)。 飛行活動は、自発運動活動と並行して年齢とともに著しく増加した(ボンフェローニ補正を用いたフィッシャーの直接確率検定: P < 0.05、図 3C)。 赤い領域に滞在する期間は年齢とともに大幅に減少しました(Kruskal-Wallis: H = 19.634、df = 4、P < 0.001、Steel-Dwass: P < 0.05、図 3D)。これは、男性が徐々に光を好むことを示しています年齢とともにあるエリア。
マルハナバチのオスの行動活動の年齢依存的変化: (A-B) 自発的な運動活動、(C) 自発的な飛行活動、および (D) 赤い領域に滞在する時間によって示される光の好み。 運動活動と赤い領域に滞在する期間は箱ひげ図で示されます。 Steel-Dwass 検定 (P < 0.05) またはボンフェローニ相関を伴うフィッシャーの直接確率検定 (P < 0.05) による有意差は、異なる文字で示されています。 サンプルサイズは括弧内に示されています。
行動に対するドーパミンの影響を決定するために、ドーパミンを注射された雄の運動活動と飛行活動、および光の好みを測定しました。 運動活動は、対照個体とドーパミン注射個体との間で有意な差はなかった(クラスカル・ワリス:H = 4.705、df = 3、P = 0.195、図4A)。 飛行開始までの潜時は、対照群とドーパミン注射群との間で有意な差はなかった(クラスカル・ワリス:H = 4.354、df = 3、P = 0.226、図4B)。 赤い領域の滞留時間は、対照とドーパミンを注射した個体の間で有意な差はありませんでした(クラスカル-ワリス:H = 1.209、df = 3、P = 0.751、図4C)。 したがって、ドーパミン注射は、オスの運動活動や飛行活動、光への反応には影響を与えなかった。
マルハナバチの生後 4 日の雄の行動活動に対するドーパミン注射の影響: (A) 自発運動活動、(B) 飛行開始期間、および (C) 軽い好みとして赤い領域に滞在する時間索引。 運動活動、開始期間、および赤い領域に滞在している期間が箱ひげ図で示されます。 サンプルサイズは括弧内に示されています。
自発運動活性は、10-3 M オクトパミンで治療された個体の方が対照個体よりも有意に高かった(クラスカル-ワリス検定: H = 8.764、df = 3、P < 0.05; スチール: P < 0.05、図 5A)。 10-4 M オクトパミンで治療した雄でも同様の傾向が見られましたが、対照雄との有意差は検出されませんでした。 飛行開始までの潜時は、対照個体とオクトパミンを注射した個体との間で有意な差はなかった(クラスカル・ワリス:H = 1.315、df = 3、P = 0.726、図5B)。 赤い領域での滞留期間は、対照とオクトパミンを注射した個体の間で有意な差はありませんでした(クラスカル-ワリス:H = 0.976、df = 3、P = 0.807、図5C)。
マルハナバチの生後4日雄の行動活動に対するオクトパミン注射の影響: (A) 自発運動活動、(B) 飛行開始期間、(C) 光選好指数としての赤色領域に滞在する時間。 運動活動、開始期間、および赤い領域に滞在している期間が箱ひげ図で示されます。 スチール試験による有意差 (P < 0.05) はアスタリスクで示されます。 サンプルサイズは括弧内に示されています。
エピナスチン注射後 15 分の雄の運動活動は、対照の運動活動よりも有意に低かった (Mann-Whitney U: Z = 3.304、P < 0.001、図 6A)。 注射後 24 時間の時点で、雄の活動は対照雄と治療雄の間で差がなかった(Mann-Whitney U: Z = 1.447、P = 0.148、図 6A)。これは、エピナスチンによる阻害からの回復を示しています。 エピナスチン注射後 15 分のオスの飛行開始潜時は、対照オスと比較して有意に長く (Mann-Whitney U: Z = 2.573、P < 0.05、図 6B)、オスの潜時は 24 分で抑制から回復しました。注射の時間後、対照雄と治療雄との間に差はなかった(Z = 0.534、P = 0.593、図6B)。 赤色領域に滞在する時間は、対照雄と治療雄の間で有意な差はなかった(15分:Mann-Whitney U:Z = 0.829、P = 0.407; 24時間:Z = 1.328、P = 0.184、図6C)。 。
マルハナバチの生後4日目雄の行動活動に対するエピナスチン(オクトパミン受容体拮抗薬)注射の影響:(A)自発運動活動、(B)飛行開始期間、(C)赤色領域に滞在する期間ライト好みの指標として。 運動活動、開始期間、および赤い領域に滞在している期間が箱ひげ図で示されます。 エピナスチン治療群と対照群の間の有意差は、マンホイットニー U 検定を使用して評価されました。 飛行開始の継続時間はボックス (青い破線の枠線) 内で拡大されています。 バー内の数字はサンプルサイズを示します。
ミツバチ雄蜂の蛹期の脳内のドーパミンレベルに関するこれまでの報告はなかったので、我々は雄蜂の蛹の脳内のドーパミン関連物質のレベルを測定した。 ドーパミンの 2 つの前駆体 (チロシンと DOPA) とドーパミンのレベルの変化は同様の傾向を示し、蛹期の年齢に依存しました (図 7A、B、C)。 これらの物質のレベルは年齢とともに大幅に増加し、羽化直前にピークに達し(P10-11)、その後成体羽化時に減少しました(チロシン: クラスカル-ワリス: H = 38.542、df = 5、P < 0.001; スチール-Dwass: P < 0.05、図 7A; DOPA: H = 35.346、df = 5、P < 0.001; スチール – Dwass: P < 0.05、図 7B; ドーパミン: H = 51.459、df = 5、P < 0.001; スチール – Dwass: P < 0.05、図 7C)。 ミツバチの成体蜂では、生後 8 日前後でドーパミンのピークが報告されている 22 ため、脳内のドーパミン レベルには蛹から成虫の段階まで 2 つのピークがあると考えられます。
蛹期のミツバチ雄蜂の脳タンパク質によって正規化されたドーパミン関連物質の年齢依存性変化。 チロシン レベル (A)、DOPA レベル (B)、およびドーパミン レベル (C) の変化が示されています。 エラーバーは標準誤差を示します。 Steel-Dwass 検定による有意差 (P < 0.05) は、異なる文字で示されています。 サンプルサイズは年齢の下の括弧内に示されています。
シジミミツバチなどの単系統クレード種では、雄の生殖行動の根底にある生理学的機構の研究が必要とされてきた。 ミツバチの雄蜂では、生体アミンによる生殖行動の調節が研究されています8、10、23。 しかし、マルハナバチの雄における生体アミンの適用による脳内の生体アミンレベルおよび行動アッセイに関するこれまでの報告はない。 本研究は、原始的な真社会性ミツバチの雄の行動活動におけるドーパミンとオクトパミンの機能を初めて明らかにしたものである。
マルハナバチのオスでは、脳内のオクトパミンレベルが蛹中期から成虫の段階で増加しました。 成人男性の運動および飛行活動も、性的に成熟する年齢(生後 8 日)までは年齢とともに増加しました。 これらの結果は、オクトパミンが加齢に伴う行動活動の増加と同時に起こる潜在的な神経活性物質であることを示唆しています。 次に、薬物注射による行動活動に対する生体アミンの影響をテストしました。 オクトパミン注射は運動活動を増加させましたが、エピナスチンは運動活動を減少させ、飛行開始の潜伏期間を延長しました。 エピナスチンはオクトパミン受容体を介してアンタゴニストとして作用するため、この結果は、オクトパミン作動性シグナル伝達の遮断により運動活動と飛行活動が低下し、したがってオクトパミンがマルハナバチのオスのこれらの活動を強化することを示しています。 ミツバチのドローンでは、オクトパミンの脳レベルと運動および飛行活動が年齢とともに増加しました10,23。 オクトパミンの注射により、ドローンの飛行活動が強化されました23。 オクトパミンのレベルとオクトパミンの行動機能の変化は、マルハナバチの雄とミツバチの雄蜂の間で共有されています。
オクトパミンとは対照的に、成虫期の脳内のドーパミンレベルは成虫羽化直後に減少し、ドーパミン注射はマルハナバチのオスの行動活動には影響を与えませんでした。 これらの結果は、少なくとも成虫になってから 4 日目のマルハナバチのオスの行動活動の増加にドーパミンが関与していないことを示唆しています。
私たちは、蛹の段階におけるミツバチ雄蜂の脳内のドーパミンレベルの変化を測定し、マルハナバチのオスの脳内のドーパミンレベルの変化と比較しました。 ミツバチの蛹のドーパミンレベルは年齢とともに増加し、成虫が羽化する直前にピークに達しました(P10-11)。 成人期のドーパミンレベルは年齢とともに増加し、羽化後 8 日目にピークに達することが以前に報告されています 10,22。 したがって、ミツバチの雄蜂の脳内のドーパミンレベルには、蛹から成虫の段階までに2つのピークがありました(図8、赤線)。 ミツバチの雄蜂のドーパミンレベルには2つのピークがあるのとは対照的に、マルハナバチのオスのドーパミンレベルは、蛹の中期から成虫の初期段階にかけてピークに達したのは1回だけでした(図8、青線)。 これら 2 つの種の間での成体段階でのドーパミン レベルの変化のこの違いは、共通の祖先から 2 つの種に至る進化のプロセスについての重要な洞察を提供する可能性があります。 ミツバチの雄蜂では、ドーパミンは運動活動と飛行活動を強化します 10,23。これは、性的に成熟した年齢でのドーパミンレベルのピークに対応します (A8)。 単独行動する昆虫では、ドーパミンは D. melanogaster の運動活動と性行動を強化し、29、30、31、大型のクマバチである X. appendiculata の運動活動と飛行活動を強化します 24。 これらの結果は、運動および飛行活動に対するドーパミンの効果が、いくつかの単独種の種とミツバチのオスの間で共有されている可能性があるが、マルハナバチでは共有されていないことを示唆しています。 祖先の特徴が蛹から性的に成熟した成体段階までのドーパミンのピークが 1 つであるか 2 つであるかを判断する必要があります。
ミツバチとマルハナバチのオスの脳内のドーパミンレベルの変化の比較。 赤と青の線は、それぞれミツバチ (Apis mellifera) とマルハナバチ (Bombus ignitus) のドーパミン レベルを示します。 ミツバチのドーパミンデータは、本研究と、Harano et al.22、Watanabe、Sasakiによる研究32によって得られました。
マルハナバチのオスの運動活動や飛行活動に対するドーパミンの効果は、成虫段階でドーパミンのピークが欠如しているために失われているか、使われていない可能性があります。 ミツバチの雄蜂では、成体初期のドーパミンのピークは、幼若ホルモン(JH)と食物摂取の影響によって生成されます8。 血リンパ中のJH力価は、脳内のドーパミンレベルと同様に、性的成熟まで年齢とともに増加します22、33、34。 JH は、ドーパミン生合成に関与する酵素の遺伝子発現を強化し、脳内のドーパミンのレベルを増加させます 22、23、32、35。 マルハナバチのオスでは、成体初期段階では JH 力価が上昇せず、ドーパミン生合成を刺激しない可能性があります。 ミツバチからチロシンを含む食物を摂取すると、ドーパミン生合成酵素の遺伝子発現が亢進し、ミツバチの雄蜂の成体初期段階でドーパミンのレベルが増加する可能性があります 32,36。 マルハナバチの成虫の雄は働きバチから餌を受け取らないため、ミツバチの雄蜂よりもチロシンを摂取する機会が少ない可能性があります。 これもドーパミンが増加しないもう一つの理由かもしれません。
この研究では、生体アミンとマルハナバチ (B. ignitus) 雄の生殖行動との関係を調査しました。 また、生殖行動の制御の進化についての洞察を得るために、マルハナバチとミツバチの関連メカニズムを比較しました。 成人の脳内のオクトパミンレベルは、運動や飛行活動、光の好みと並行して年齢とともに増加しましたが、ドーパミンレベルは増加しませんでした。 オクトパミンとエピナスチンの注射は、運動活動と飛行活動に逆の影響を与えましたが、ドーパミンは影響しませんでした。 これらの結果は、オクトパミン作動性システムがマルハナバチの雄の生殖行動に関与する運動活動と飛行活動を強化することを示唆しています。 ドーパミンとオクトパミンがミツバチのドローンの飛行活動を促進することが報告されています。 したがって、飛行を促進するオクトパミンの機能はマルハナバチとミツバチのオスで共通しているが、ドーパミンの増加に伴うドーパミンの行動機能はマルハナバチのオスでは観察されなかった。
商業的に飼育されたマルハナバチ (B. ignitus) コロニーは、Sasaki et al.37,38 によって記載された手順を使用して木箱に保管されました。 雄の蛹は、12 の queenright コロニーの繭から収集されました。 蛹の年齢を特定するために、白い複眼を持つ白い雄の蛹を生後 0 ~ 1 日の蛹 (P0 ~ 1) と定義しました。 生後 0 ~ 1 日の蛹を、暗所一定条件下で 28 °C に保ったプラスチックカップ(Φ98 mm × 96 mm)に移し、0 ~ 1、2 ~ 3、4 ~ 5、6 ~ 7、蛹化後8〜9日。 新たに羽化した成人雄(生後0日の雄)の胸部にペイント(ペイントマーカー、三菱、日本)でマークを付け、年齢を特定した。 標識を付けた雄を母コロニーに戻し、特定の年齢でコロニーから収集した。 集められた雄は、脳内の生体アミンのレベルの測定と行動実験に使用されました。 生体アミンのレベルの測定に使用されるサンプルは、11:00 ~ 13:30 に収集されました。 それらは液体窒素で安楽死させられ、分析まで液体窒素中で保管された。
ミツバチ (A. mellifera) 雄蜂の蛹と羽化したばかりの成虫は、東京の玉川大学の養蜂場で保管されている通常の女王蜂のコロニーから入手されました。 雄蜂の蛹を得るために、雄蜂と働き虫の櫛のベースの面積が等しい櫛フレームをコロニーに導入し、働き蜂がその上に櫛の細胞を構築できるようにしました。 ドローンコームセルに蓋をした後、フレームをコロニーから取り出し、33℃に保たれたインキュベーターに移しました。 蛹の年齢は、Jay39 が記載した方法に基づいて特定されました。 新たに羽化した成虫もドローンコームセルから収集されました。 蛹と新たに羽化した成体ドローンは 11:00 ~ 13:30 に収集され、液体窒素で安楽死させられ、ドーパミン関連物質が測定されるまで液体窒素中で保管されました。
液体窒素中で保存したマルハナバチとミツバチの頭部を、ペルチェ冷却ユニット(Kenis Ltd、大阪、日本)上の0.1 M リン酸緩衝液(pH 7.0)中で約4℃で顕微鏡下で解剖しました。 解剖した脳を、0.1 ng/μL 3, 4-ジヒドロキシベンジルアミンを含む氷冷した0.1 M 過塩素酸 100 μL中でマイクログラスホモジナイザーを用いて2分間ホモジナイズしました。 次に、各サンプルを 1.5 mL 微量遠心管に移し、15,000 × g、4 °C で 30 分間遠心分離しました。 各上清をマイクロバイアルに移し、HPLC-ECD システムで分析しました。
佐々木らによって開発されたドーパミン、オクトパミン、およびチラミンのレベルの測定に使用された HPLC-ECD システム 40 は、溶媒送出ポンプ (PU-4180、Jasco、東京、日本)、冷凍自動インジェクター (AS-4050、Jasco) で構成されていました。 、および C18 逆相カラム (250 mm × 4.6 mm id、平均粒子サイズ 5 μm; UG120、大阪ソーダ、大阪、日本) を使用し、温度を 35 °C に維持しました。 ECD (ECD-700、EICOM、京都、日本) は 0.85 V に設定され、35 °C で使用されました。 移動相は、0.18Mのモノクロロ酢酸および40μMの2Na−EDTAを含有し、NaOHでpH3.6に調整し、1.62mMの1−オクタンスルホン酸ナトリウムおよび5%のCH3CNをこの溶液に添加した。 流速は0.7 mL/minで一定に保った。
松山らによって開発されたチロシンおよび 3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン (DOPA) レベルの測定に使用された HPLC-ECD システム 41 は、溶媒送出ポンプ (AS-4580、Jasco)、冷却自動インジェクター (AS-4550、Jasco) で構成されていました。 、および C18 逆相カラム (250 mm × 4.6 mm id、5 μm 平均粒子サイズ; MG、大阪ソーダ) を使用し、温度を 35 °C に維持しました。 ECD (ECD-700、EICOM) は 0.84 V に設定され、35 °C で使用されました。 移動相には 83 mM クエン酸一水和物、17 mM 酢酸ナトリウム、13 μM 2Na-EDTA、および 2.3 mM ナトリウム-1-オクタンスルホン酸塩が含まれており、この溶液に 7% メタノールを加えました。 流速は0.7 mL/minで一定に保った。 どちらの HPLC-ECD システムでも、生体アミンを同定および定量するために、サンプルの分析の前後に外部標準を分析しました。 ピークは、保持時間および流体力学ボルタモグラムを標準について得られたものと比較することによって特定されました。 クロマトグラムのピーク面積に基づく測定値は、標準のピーク面積に対する物質のピーク面積の比率を計算することによって得られました。
脳内のタンパク質含有量に基づいて生体アミンのレベルを正規化するために、ブラッドフォード法 42 を使用してタンパク質の量を測定しました。 生体アミンを抽出した後に脳組織から得られた沈殿タンパク質ペレットは、Sasaki et al.40 によって記載されているのと同じ手順で処理されました。 反応した各サンプルの吸光度を、マイクロプレートリーダー(MPR-A100、アズワン、大阪、日本)を使用して波長590 nmで測定しました。
母コロニーから採取した雄は、行動実験まで 28 °C の透明シートカバーが付いたリング状チャンバー(外径 150 mm、内径 90 mm)に個別に移送されました(図 S4)。 行動実験は、Sasaki et al.43 の記載に従って実施されました。 透明なカバーシートを十字線で 4 つの部分に分割し、透明なカバーの半分を赤いプラスチック シートで覆い、室内の昆虫に暗い (赤い) 領域を提供しました。 5 分間順応させた後、各ミツバチの自発運動活動をデジタル ビデオ カメラを使用して 15 分間記録しました。 ビデオデータ記録において十字線の十字の数をカウントした。 さらに、動いていない個体および歩いている個体もカウントした。 光の好みを決定するために、赤いプラスチックシートの下に留まる時間を記録した。 運動活動と光の好みを測定した後、Sasaki et al.43 の記載に従って、28 °C のネットケージ (45 cm × 60 cm × 45 cm) で飛行開始の潜時を測定しました (図 S4)。 雄を含む部屋を赤いプラスチックシートで完全に覆い、ネットケージに移した。 その後、雄が自発的に飛べるように赤いシートが取り外されました。 赤いシートを剥がしてから5分間観察した際の飛行挙動を「飛ばない」(羽ばたき含む)と「飛ぶ」の2段階に分類した。 「飛行」個体の飛行開始までの潜時が記録された。
2 μl のドーパミン (Sigma-Aldrich) およびオクトパミン (Sigma-Aldrich) 溶液 (10-4、10-3、および 10-2 M) を 0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.0) または 2 μl の 0.1 M リン酸緩衝液に溶解しました。バッファ(コントロール)。 エピナスチン (TCI、東京、日本、オクトパミン受容体拮抗薬 44,45) を 0.1 M リン酸緩衝液に 10-2 M の濃度になるように溶解しました。マルハナバチの移動、光の好み、飛行行動における生体アミンの役割を調べるため、雄では、細い針が付いた 10 µL マイクロシリンジを使用して、調製した溶液を生後 4 日の雄の腹部に注射しました。 薬物注射後、運動活動を観察するまでの順応期間は 15 分でした。
すべての統計分析は、R ソフトウェア (バージョン 4.1.2、https://cran.r-project.org/) を使用して実行されました。 生体アミンのレベルは、Kruskal-Wallis 検定とそれに続く Steel-Dwass 検定を使用してグループ間で比較され、ペアごとに比較されました。 運動活動と赤い領域での滞留時間も、Kruskal-Wallis テストに続いて Steel-Dwass テストを使用して分析されました。 ボンフェローニ補正を備えたフィッシャーの直接確率検定を使用して、運動活動 (「動かない」対「歩く」) および飛行活動 (「飛んでいない」対「飛んでいる」) の割合を調べました。 男性の行動活動は、クラスカル・ウォリス検定に続いてスティール検定(対照対治療)を使用して検査されました。 エピナスチンの投与または非投与で治療された男性の行動活動は、マン・ホイットニー U 検定を使用して比較されました。
現在の研究で使用されているすべてのデータは、論文およびその補足資料内で入手できます。
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本研究は、KS に対する日本学術振興会 (JSPS) 科研費 [助成金番号 JP20K06077] の支援を受けて行われました。
玉川大学大学院農学研究科(〒194-8610 東京都町田市)
Tomohiro Watanabe & Ken Sasaki
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KS と TW がこの研究を発案しました。 KS と TW が実験を設計しました。 TWは実験を行いました。 KS と TW はデータを分析しました。 TW が原稿の本文を書き、KS が原稿をレビューして編集しました。
佐々木健さんへの手紙。
著者らは競合する利害関係を宣言していません。
シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。
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転載と許可
渡邉哲也、佐々木和子、マルハナバチ雄における生体アミンの行動的役割。 Sci Rep 12、20946 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-25656-7
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受信日: 2022 年 9 月 20 日
受理日: 2022 年 12 月 2 日
公開日: 2022 年 12 月 5 日
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25656-7
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